多系统萎缩患者TCRα链CDR3谱系的荧光定量PCR溶解解读

TCRa链CDR3PCR溶解作者：田丹，孙永萍,汤贤英,马锐研室，贵州遵义563003

作者单位：1.遵义医学院免疫学教PCR1例多系统萎缩TCRa链CDR311(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC中的总RNA逆转录成cDNA32TCRa链胚系可变区基因家族(TRAV)TCRa(TRAC)设计下游引物，荧光定量PCR(FQPCR32个TRAVSCDR3谱系，溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单、寡、多克隆增生，挑选单克隆进行PCRT增，扩增产物行普通琼脂糖PBMC32个TCRaTRAV家族CDR3FQPCR产物的各家族相对定量表达不一；正常人的32TCRa链TRAV家族CDR3TRAV10TRAV15TRAV29CDR3谱型的溶解曲线表现为单峰的克隆性增生，其他家族为多峰、寡峰TRAV15家族的测序得到的CDR3氨基酸组成为：SAIYFCAEDRDSTLTF结论：该多系统萎缩患者的PMBC中，存在TCRa链CDR3谱系漂移。【关键词】多系统萎缩，，荧光定量PCR溶解曲线[Abstract]Objective:ToanalyzeCDR3spectratypeofTCRalphageneinperipheralbloodmonouclearcells(PBMC)ofonepatientwithmultiplesystematrophy(MSA)byusingDNAmeltingcurvetechniquewithrealtimefluoresceneequantitativepolymerasechainreaction.Methods:TotalRNAfromPBMCofahealthydonorandaMSApatientweretranscriptedreverselyintocDNArespectively.Theforwardprimersweredesignedaccordingtothe32humanTRAVgenefamilies,andthereverseprimersdesignedaccordingtoTRAC.FQPCRwascarriedouttoamplifyCDR3spectratypingofthe32humanTRAVgenefamilies(HTGF),andthemonoclonal/oligoclonal/polyclonalCDR3wereanalyzedwithDNAmeltingcurves.MonoclonalTcellsofTRAVfamilieswereamplifiedandsequeneed.Results:TheFQ PCRproductsofHTGFoftheMSApatientweredifferentfromthoseofnormalpeople.The32HTGFmeltingcurvesofnormalpeopleshowedGaussiandistributionwithseveralpeaks,whilethoseoftheMSApatientshowedmonopeakcloningincreaseinTRAV10,TRAV15,andTRAV29genefamilies,andmultipeak/oligpeakmultclone/oligeloneincreaseinothergenefamilies.Nodeletionfamilywasfound.TheCDR3aminoacidsequeneeofTRAV15whichshowedmonopeakwastotheDNAsequeneeobtained.inferredasSAIYFCAEDRDSTLTFGaccordingConclusion:TheremightbespectratypingdriftinCDR3onTCRalphachaininPBMCofMSApatient.［Keywords］multiplesystematrophy;complementaritydeterminingregions;realtimefluoresceneequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction;meltingcurve多系统萎缩(multiplesystematrophy,MSA是一组原因未明成年起病的神经系统多个部位相继进行性萎缩的疾病或综合征。由于该病患病率较低，症状与帕金森综合征、震麻痹症等神经病症相似，早期明确诊断比较困难，目前也尚无特异性的治疗方法，临床对症治疗为主，患者预后较差 ［1，2］。目前，多系统萎缩的相关研究主要集中在分子生物学及蛋白质病理学领域，而在免疫学方面少见研究报道［3］。近年来，TCRCDR谱型的免疫指纹技术在病毒感染、肿瘤、自身免病的研究中得到了较为广泛的应用 ，但受到较多关注的是TTCRB链CDR3谱系的研究，而TCRa［4］。前期研究中已建立TCRaBCDR3技术”，并对1MSA患者外周血TCRB链CDR3I［5〜8］。现拟通过对该例患者TCRa32CDR3谱系进行分析，初步探讨TCRaCDR3I系的变化及这种变化在MSA疾病过程中的可能意义，为进一步增加病例样本的研究提供基础。材料和方法研究样本及细胞株1例多系统萎缩患者，按多系统萎缩临床诊断标准确诊［8］。患者外周血，来源于遵义医学院第一附属医院；对照样本为正常志愿者外周血。对照子宫颈癌细胞株(JEC)遵义医学院微生物学教研室提供。试剂总RNA(TIANGENcDNA合成kit(MBI,Fermentas)，RealtimePCRMasterMix(TOYOBO等。引物设计与合成参照文献［5〜7］TCRAV3234条(TRAV1和TRAV42个亚家族)TCRAC1GAPDinvitrogen英骏生物技术有限公司合成。RNA提取和cDNA合成分别采集多系统萎缩患者和正常人外周血5ml,按密度梯度离心法分离PBMC,按总提取试剂盒操作，提取JEC细胞1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核纟田胞(peripheralbloodmononuclearcell ，PBMC)(2<106)RNAcDNAkit条件，用OligodT引物逆转录制备cDNATRAV家族CDR：cDNAFQPCF扩增36个PCF1〜34管分别加入TRAV1至TRAV321游弓I11(10mmol/L,TRAV1和TRAV42个亚家族)，1〜34管每管加入TRACT1l35管加GAPD36管为无引物的阴性对照管；每个PCR1lMix10l7l20l;标准曲线JECGAPD表达量为相对量标准进行PCR反应条件：(1)94C3min，1cycles;94C30sec，55C30sec，72C50sec，45cycles;72C10min，1cycles;(2)溶解曲线分析：75〜95C0.2C/s读取荧光值，100cycles;(3)溶解曲线分析后的PCRT(1)45cycles5cyclesPCR8lPCR1.5%-20C保存备用。PCR产物序列分析反应体系：TRAV15FQPCR^2l，加入TRAV15±2l(10mmol/L)TRACT2l，TaqDNAPolymerase0.25卩l，2mmol/LdNTP5卩l，10倍BufferwithKCL，MgCl25卩l，25mmol/LMgCl23卩l，DDW30.75卩l，总体积50卩l。反应条件：95C2min，1cycles;95C30sec，1min，35cycles;72C10min，1cycles2结果

60C1min，72CPBMC32个TCRaTRAV家族CDR3FQPCR产物溶解曲线峰图均为多克隆的高斯分布(1)。患者PBM32个TCRaTRAVCDR3谱型的FQPCR产物的各家族溶解曲线峰图中的TRAV10TRAV15TRAV29隆和寡克隆增生峰图，未出现缺失的家族(2)。对患者所出现的TRAV15寡克隆性的PCR，CDR3区的基因序列：TCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGGATAGAGACAGCACCCTCACCTTTGGGACAGGGGACTAT(3);翻译后相应的CDR区氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLT8(1)3讨论MSA11969常、慢性病毒感染、神经元凋亡、少突胶质细胞胞质内包注：呈现单峰的家族为：TRAV10TRAV15TRAV29;对照涵体等导致的进行性神经系统多系统变性［1〜3］。在免疫学方面的研究，Hiroyuki［9］等认为白介素la、白介素8、细胞黏附因子［MSA勺发病有相关性。随着TCR在获得性免疫应答中的不断深入研究，目前发现每个 T细胞有着TCRCDR分子，不同TCDR3(不同长度)，从CDR3基因谱型，CDRTCR的特异性，或者说，CDR湘当于TCDR的频率变化(谱系漂移)T细胞克隆扩增的程度，从而反映T细胞功能状态。本研究组目前已建立了监测人TCRa链和B链CDR3谱系免疫扫描谱型分析技术和荧光定量溶解曲线分析技术,对多例白血病、图3患者TRAV15家族CDR3X测序结果表1患者TCRAV15家族CDR区测序结果翻译后的氨基酸序列大肠癌等患者进行了 TCRCDR3［57］。MSA患者PBMPBMC勺32个TCRa链TCRAV家族CDR3f型的 产物的各家族相对定量表达不一，其中TRAV10TRAV15TRAV29家族表现为单克隆增生，其他家族多克隆和寡克隆，未出现缺失的家族，正常人的 TCRa链CDR3I型荧光定量PCR溶解曲线为高斯分布⑹。对单克隆增生的TRAV15V的CDR3区的基因序列：TCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGGATAGAGACAGCACCCTCACCTTTGG翻CDR宓氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLTFGRAV1CTRAV292个单克隆增生家族的PCF纯度和寡克隆干扰相关。以上结果提示该MSAt者TCRa链CDR列能存在谱系漂移。由于这种病例较为少见，本研究仅获得1MSAtTCRaCDR3谱系研究资料，进一步研究将扩大样本量，探讨漂移家族TCDR3的作用，为该疾病寻找新的辅助诊断指标及指导临床对患者的个性化治疗提供依据【参考文献】［1］王博，张朝东，李昭，等.多系统萎缩的临床特征与疾病进展的特点［J］.神经病学杂志，2007(6):407-410.［2］赵景礼.多系统萎缩的回顾与进展［J］.临床神经病学杂志，2000(6):377-378.［3］庄柏翔.多系统萎缩基础及临床研究［J］.中国医师进修杂志,2006(8);10-12.［4］姚新生.TCRB链CDR3I［J］.国际免疫学杂志，2007⑷：240-243.[5]等.TCRCDR3定[J].中华微生物和免疫学杂志，2006(6)571-573.⑹等•PCRaCDR3[J].中国免疫学杂志，2009(8):