15第十五章核酸的研究方法

第十五章核酸的研究方法生物化学一、DNA的分离二、RNA的分离三、核酸含量的测定法第一节核酸的分离、提纯和定量测定核酸制备的原则防止核酸的降解和变性采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。一、DNA的分离真核生物细胞中的染色体DNA与碱性的组蛋白结合在一起，成为核蛋白（DNP），DNP溶于高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，低盐沉淀，使DNP纤维沉淀出来。用玻璃棒将DNP纤维缠绕在棒上，再经多次溶解和沉淀以纯化DNP。二、RNA的分离分离RNA时要特别注意防止RNase对RNA的降解。RNase无处不在，且耐高温，不易灭活。制备RNA通常需要注意3点：①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。三、核酸含量的测定法紫外分光光度法（260nm）定磷法（钼蓝比色法）

先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm)DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm处定糖法第三节核酸的凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖

一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。一、琼脂糖凝胶电泳

以琼脂糖凝胶为支持物时，DNA电泳的迁移率决定于以下因素：（1）核酸分子的大小。迁移率与分子量的对数成反比。（2）胶浓度。胶浓度大则网孔小，核酸的迁移率变小。（3）DNA的构象。超螺旋的DNA迁移率>线性DNA>开环DNA

但凝胶中的溴乙锭浓度对此有影响。EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红-橙色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。

电泳后将胶浸泡在溴乙锭溶液中染色，紫外光照射下观察电泳结果。也可在制胶时就加入溴乙锭，这样可以在电泳过程中用紫外灯照射，观察电泳的进程。扁平状染料与DNA的结合吖啶橙溴（化）乙啶

1ngDNA条带可显示第五节聚合酶链反应（PCR）PCR：是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术。1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。原理：1DNA变性，两条链解开

2引物模板退火，二者碱基配对

3DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在

引物的引导下合成与模板互补的DNA新链

4重复此过程，DNA以指数方式扩增PCR

PCR动画1stcycle2ndcycle3rdcycle过程变性引物退火延伸1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍Juang

RH

(2004)

BCbasicsCAGGTCCAGCAGGCCCAGGCC+

polymerase+

primerreplicationCGGGCCMutantThrtranslation定点突变

Wild

typeCAGGTCValtranslationWild

type

proteinMutant

protein(1)

(2)primer(3)(5)(4)(6)突变只改变了一个氨基酸

Val

→

ThrSmith

(1993)基本步骤：设计一对引物优化反应体系：模板、引物、4种dNTP，耐热DNA聚合酶、Mg2+选择3个温度进行热循环(25~30个周期)：

变性94℃

退火45~60℃

延伸(1min)，循环25~30个周期，最后延伸10min应用电泳技术，检测扩增结果.标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L10×扩增缓冲液

PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4小时PCR技术的应用用于合成特异探针；用于DNA的测序；将逆转录与PCR相偶联（RT-PCR）；

用于基因定位诱变；末知序列的PCR扩增；基因组序列的比较研究；

用于临床诊断（遗传病，癌基因的检查等）。生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-timePCR）/基因表达谱研究（DNAchip,SAGE）医学领域应用疾病基因