免疫学和免疫学检验：沉淀反应

免疫学和免疫学检验：沉淀反应沉淀反应（precipetaiton）1897Kraus沉淀反应（precipetaiton）1897Kraus清混合时可发生沉淀反应。1905Bechhold另一方面，免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。 沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合第二阶段形成可见的免疫复合物（参见第九章）。经典的沉淀反应在第二阶观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法；而快速免疫浊度法在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。现代免疫技术（如各标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫方法的核心技术。第一节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验为历史较久，又较有用的方法。该法要点是：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。（一）抗原稀释法抗原稀释法（Dean-Webb法）是将可溶性抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，置室温或37℃反应后，产生的沉淀物随抗原的变化而不同。表12-1系以牛血清白蛋白为例的实结果。表12-1Dean-Webb定量沉淀试验管号抗原抗体总沉淀量反应过剩物抗原沉淀量抗体沉淀量沉淀中Ab/Ag10.0030.680.093Ab0.0030.09030.020.0050.680.145Ab0.0050.14028.030.0110.680.249Ab0.0110.23821.740.0210.680.422Ab0.0210.40119.150.0320.680.571Ab0.0320.53916.860.0430.680.734－0.0430.69116.170.0640.680.720Ab—－－80.0850.680.601Ag—－－90.1710.680.464Ag—－－100.3410.680.368Ag－－－单位：mmol/L12-17～10616:1，即最适比。（二）抗体稀释法（Ramon）法本法采用恒定的抗原量与不同程度稀释的抗体反应，计算结果同上法，得出的是抗体结合价和原和抗体同时稀释，称为棋盘格法（亦称方阵法），找出最佳配比。举例见表12-212-2抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/6401/12对照1/5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋±－－1/10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/40－±＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－1/80－－－－＋＋＋＋－“＋”为沉淀物量：为最适比从12-21:401:3201:160，1:20Ascoli19021.5～2mm1/3抗原溶液。因抗血清蛋白浓度高，比重较抗原大，所以两液交界处可形成清晰的界面。此处抗原抗体反应生成的沉淀在一定时间内不下沉。一般在室温放置10min3～20μg/ml形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉98％以上，凝胶形成网络，将水分固相化。抗原和抗体蛋白质在此凝胶内扩散，犹如在液体中自由运动。大分子（20）子量的差别。另外，由于琼脂网孔有一定的限度，抗原抗体结合后，复合物的分子量至少应在百万以上，这种超大分子则被网络在琼脂中，经盐水浸泡也只可根据抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向扩散试验和双向扩散试验。局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形成可分为试管法和平板法两种。（一）Oudin194650℃0.7％琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，待凝固后，在凝胶中面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光处，极易观察这种白色不透明沉淀带。沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响。溶液内含有多种抗原，在凝胶中含有各自的抗体，扩散后形成相应的抗原抗体复合物，出现多条区带。试管上部的沉淀带表示抗原量少或者抗体量多；反之，下面的沉淀带则是抗原量大，抗体量少。另外，抗体类型也有很大区别，如用兔抗血清（R型抗体），抗体过量亦可形成复合物，因而沉淀带宽而界线不清；如用马抗血清（H型抗体），抗原或抗体过量皆不形成复合物，因而只在比例合适处形成界线清晰的沉淀物（图12-1）。12-1（二）平板法此法由Mancini19650.9％琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（3～5mm），37℃向四周扩散，24～48h（12-2）。图12-2单向辐射状免疫扩散上排为5个不同的参考中、下排为患者2直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同时，这种沉淀还与分子量和抗散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法：1．Mancini呈线性关系（12-3）。利用公式表示：C/d2＝K12-3ManciniT11624h；T224～48h；T348hT3，T1C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数2．Fahey（24h）12-4）。用公式表示：log/d＝KC＝抗原浓度（mg/d），d＝＝3SRID1.25μg/ml（单向扩散技术的敏感度）IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等5～712-2）。按扩散时间（FaheyMancini）的不μg/ml）。另外，以下影响因素也应注意。1．抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而且还应注意存放的方法，防止效价下降。2．标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长期应用。3．测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。4．有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出αα重IgA（12－2）。12-4Faheyt11624h；t22448h；t348ht1为直线，t35．在单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符Ig6．测得结果的假阳性升高现象与上面相反，如用多克隆抗体测定单克隆病（M），则抗原相对过剩（单一抗原决定簇成分），致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加。二、双向扩散试验在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。（一）OakleyOudin（二）Ouchterlony3～5mm花孔、双排孔、三角孔等（12-5）。在相对的孔中加入抗原或抗体，置室温37℃18～24h31．说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗体的纯度。12-52．体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。12－615kD，未知抗原的分子量可做粗略估计。12-63．抗原的性质完全相同、部分相同或完全不同。三种情况在双向扩散中表现的基12-712-7（Ag-a）完全相同，形成一个完全融合的沉淀线；右图中抗体为双价，两种抗原完全不同（Ag-aAg-c）；中图的抗体为双价，两种抗原（Ag-abAg-ac）abc作为抗原的分析，是目前免疫化学中最常用的鉴定技术之一。图12-7三种扩散基本图型4．用于抗体效价的滴定双向扩散技术是血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。第三节 免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳技术的种类很多，这里仅将常用的技术介绍如下。一、免疫电泳免疫电泳为区带电泳与免疫双向扩散的结合，是由Grabar和Williams（1953）首先报道的。方法是先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离开，然后与电泳方向平行在两侧开槽，加入抗血清。置室温或37℃使两者扩散，各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形淀线（图12-8）。根据各蛋白所处的电泳位置，可分为白蛋白区、球蛋白α1区、α2区、β区和γ 区。各区带常见血浆蛋白见表12-3和图12-9。12-8A1b：12-3带所含蛋白成分ALBα1α2β γ白蛋白α1-抗胰蛋白酶触珠蛋白转铁蛋白IgG前白蛋白α1-酸糖蛋白铜蓝蛋白C3a、C3bCRPα1脂蛋白抗糜蛋白酶2-巨球蛋白IgA、IgM、IgD、纤维蛋白原、β112-9PreALB：前白蛋白；HP：触珠蛋白；α1；ALB：白蛋白；TRF：转铁蛋白βLIP：β脂蛋白；AAT：蛋白酶；AAG：酸糖蛋白；α2M：α2件，如缓冲液、琼脂和电泳等皆可直接影响沉淀线的分辨率。对于免疫电泳的分析，更重要的是经验的积累，只有多看，多对比分析，才能作出恰当的结白的识别等方面。二、对流免疫电泳对流免疫电泳实质上是定向加速度的免疫双扩散技术，其基本原理是：在琼脂板上打两排孔，左侧各孔加入待测抗原，右侧孔内放入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电荷的抗原泳向阳极抗体侧，而抗体藉电渗作用流向阴极抗原侧，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线（12-10）.12-10①Ag；②Ag；③Ag强阳性；④AgIgG，4表现。G3G4G1G2IgGIgG2～3mA/cm12-11）。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。12-112．注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形3．标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底峰形，使定量不准。4．IgGIgG（甲酰化），IgGμg/ml125I形成不可见的放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计ng/ml（immunofixationelectrophoresis，IFE）Alper白质的鉴定。该法原理类