物源性SOD的提取、分离纯化及其生物学研究

实验设计书题目植物源性SOD的提取、分离纯化及其生物学研究指导老师班别：11生物技术姓名：成员实验一．大蒜中超氧化物歧化酶的提取、分离纯化实验原理自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的提取制备；（3）粗酶液3种方法连续纯化（4）酶活和蛋白质含量测定仪器、试剂及其制备试剂0.05mol／L磷酸缓冲液(pH为7．8使用91．5mLO．05ml／LNaHPO4与8．5mLO．05mol／LNaH2PO4配置而成);氯仿一乙醇混合液(氯仿：乙醇为3：5)；丙酮：用前冷却到4℃，硫酸铵葡聚糖G-75层析柱仪器电子天平高速离心机，水浴振荡锅、紫外可见分光光度计。方法和步骤粗提取方法磷酸缓冲液法：将蒜瓣去外膜，置于研钵中研磨至蒜泥状，加入3倍体积的磷酸缓冲液，浸泡30～45min后用6层纱布抽滤，将滤渣再用2倍体积磷酸缓冲液浸泡30min后，6层纱布抽滤。如此反复共3次，收集3次抽滤所得滤液.2.SOD的沉淀分离粗酶液中加入0．6倍体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r／min离心15min，得到SOD沉淀，将SOD沉淀溶于磷酸缓冲液中，于55～60℃热处理15min，5000r／min离心15min，弃去沉淀，得到SOD酶液。3.纯化方法硫酸铵分级盐析法：将硫酸铵晶体研磨成粉末后，称取一定质量的硫酸铵粉末缓慢加入SOD粗提液，使之达到50%的饱和度，再放置于4℃冰箱30min，10000r/min冷冻离心20min，除去杂质蛋白，取上清液，测量体积，在上清液中再加入硫酸铵粉末使之达到90%饱和度，放置于4℃冰箱2h，10000r/min冷冻离心20min，收集沉淀。将沉淀溶于5mmol/L、PH7.8磷酸缓冲液。注：0℃下硫酸铵初浓度为0%，终浓度为50%时，每100ml溶液中加固体硫酸铵29.1g；起始浓度为50%，终浓度为90%时，每100ml溶液中加固体硫酸铵26.8g。将提纯后的SOD溶液上葡聚糖G-75层析柱，台式记录仪每划一个峰均用试管收集。试管的SOD活性。氯仿一乙醇沉淀法：将氯仿一乙醇混合液，按酶液体积的O．25将其加入酶液中，搅拌15min，5000r／min离心15min，弃沉淀，将上清液置于试管中静10min后测其SOD酶活力。丙酮沉淀法：粗酶液中加入O．6倍体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r／min离心15min，得到SOD沉淀，将SOD沉淀溶于磷酸缓冲液中，于55～60℃热处理15min，5000r／min离心15min，崎岖得到SOD酶液。测其SOD酶活力。实验二．考​马​斯​亮​蓝​G​-​2​5​0​法测定蛋白质含量实验原理根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。仪器、试剂及其制备仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100ml×2、50ml×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。试剂：蒸馏水、标准蛋白质溶液：（用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液）、考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:（称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存）实验步骤1.取纯化的酶液2、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。管号12345678蛋白质标准液（ml）01.0蒸馏水（ml）1.00考马斯亮蓝染液55555555蛋白质含量（μg）0102030406080100A5952、样品中蛋白质含量测定另取两支干净的试管（做一重复），标号A、B。分别加入1ml待测样品液体和5ml考马斯亮蓝染液，将两支试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。标号AB待测样品液体(ml)11考马斯亮蓝染液(ml)55A595蛋白质含量（μg）数据处理1、将测得的吸光度填入上表中，并根据数值作出标准曲线。2、计算公式：样品中的蛋白质含量（μg/g鲜重）={[查得的蛋白质含量（μg）]×稀释倍数}/[样品鲜重（g）]实验三．超氧化物歧化酶的活性测定与耐热性分析实验原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：

2O+2H→HO+O

本反应产物HO可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。材料、仪器设备及试剂试剂：0.05mol／L磷酸缓冲液(pH为7．8使用91．5mLO．05ml／LNaHPO4与8．5mLO．05mol／LNaH2PO4配置而成);130mmol/l甲硫氨酸溶液（称1.9399gmet用磷酸缓冲液定量至100ml）750umol/lNBT（称0.06133gNBTPBS定量至100ML（避光）100umol/LEDTANA2（称0.03721gEDTANA2，用PBS定量至100ml）20umol/l核黄素（称0.0753G核黄素用蒸馏水定量至100ml（避光））仪器：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支。实验步骤1.取纯化的酶液2.显色反应

取5ml指形管（要求透明度好）12支，11支为测定管，另1支为对照管，按下表加入各种溶液：

各溶液显色反应用量混匀后将2测定管和1支对照管日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。9支测定管分别在20-100℃范围内，每隔10℃设置温度测定一次，在测定之前在该温度保温10min中后才进行酶活力测定。结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性＝（Ack-Ae）/0.5AckWVt

SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质浓度

式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A为照光对照管的吸光度；A为样品管的吸光度；V为样品液总体积ml，V为测定时样品用量ml；W为样鲜重g；蛋白质含量单位为mg/g。实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳等位酶分析实验原理聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理1.1.1性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。1.1.2制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。1.1.3凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。1.2SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。试剂与器材（1号液）凝胶贮备液丙烯酰胺（Acr）29.2g甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸馏水至100mL（2号液）浓缩胶缓冲液（0.5mol／LTris-HCl缓冲液，pH6.8）三羟甲基氨基甲烷（Tris）6加蒸馏水约50mL，溶解后以6mol／LHCl调到pH6.8，定容至100mL（3号液）分离胶缓冲液（1.5mol／LTris-HCl缓冲液，pH8.8）三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.15g加蒸馏水约50mL溶解后以6mol／LHCl调到pH8.8加蒸馏水至100mL（4号液）10%十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液SDS*（电泳用）1.0g蒸馏水10.0mL（5号液）过硫酸铵（APS）溶液过硫酸铵100mg蒸馏水1.0mL临用前配置（6号液）N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）电泳缓冲液Tris3甘氨酸14.44号液10ml加蒸馏水至1000mL样品缓冲液2号液0.5mL4号液4mL甘油2mLβ-巯基乙醇1mL0.04%溴酚蓝0.5mL加水至10mL染色剂考马斯亮蓝R2500.31g甲醇125mL乙酸25mL蒸馏水100mL脱色剂甲醇250mL乙酸50mL蒸馏水200mL保存液7%乙酸水溶液器材电泳仪，垂直板电泳槽，酸度计，电导仪，分析天平，真空泵，高速台式离心机，微量加样器，染色槽，电炉实验步骤制备电泳分离胶根据样品分子量的大小，配制所需浓度的分离胶。10~100K分子量的样品，宜采用T=12%的胶，40~200K分子量的样品宜采用T=7.5%的胶。本实验采用T=10%的胶，具体配方如下：分离胶：1号液10mL3号液7.5mL4号液0.3mL蒸馏水12mL6号液18μL5号液180μL按顺序配制，加完6号液后暂时停下来，临用时再加5号液，混匀后立即装入制胶槽，约60min后就可以凝固。制备电泳浓缩胶（T=0.38%）浓缩胶：1号液1.33mL2号液2.5mL4号液0.1mL蒸馏水6.1mL6号液5μL5号液0.1mL按顺序配制，加完6号液后暂时停下来，临用时再加5号液，混匀后立即装入制胶槽，约30min后就可以凝固。制备凝胶板制备凝胶板前先用无水乙醇擦拭玻璃板内面。用2.5%琼脂封边，并用蒸馏水检验是否密封完好。密封好后用吸管缓慢加入分离胶，离顶端约1.5cm时注入蒸馏水。待界面清晰后，吸去蒸馏水，用吸管吸取配好的浓缩胶冲洗凝固的分离胶面，插入样品槽模板，用吸管缓慢注入浓缩胶。待凝固好后，在玻璃板上用记号笔划出点样槽底线，轻轻拔出样品槽模板。加样电泳连接电泳仪的直流电源，正极连在凝胶板的下端，负极连在凝胶板的上端，即有样品的一端。电流值恒为10mA。大约经过4~5h，样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂到达离凝胶底部0.5cm处，关闭电源，取下电泳板，并将两片玻璃板分开，将凝胶板小心移入染色槽中。染色、脱色加染色剂染色过夜。倾去染色液，加脱色剂将背景的蓝色脱尽，中间要更换数次脱色固定液，然后将凝胶板制成干板、扫描实验五琼脂糖凝胶电泳等位酶分析实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidumbromide,EB），在紫外光下可以检出10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移仪器、试剂及其制备仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.高压灭菌锅4.紫外线透射仪试剂1.三羟甲基氨基甲烷（Tris）2.硼酸3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚蓝5.蔗糖6.琼脂糖7.溴化乙锭8.DNAmarker9.DNA样品5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000ml5×TBE:Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20mlPh8.0凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝0.25%蔗糖40%溴化乙锭溶液(EB)0.5μg/ml3.胶板的制备(1)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（1×TBE）。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率。(2)在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。(3)使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭（用水配制成10mg/ml的贮存液）到终浓度为0.5ug/ml(4)用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。(5)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。(6)在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟），小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃(7)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4．加样DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。5．电泳在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。参考文献大蒜SOD最佳提取条件确定及其生长过程中SOD活力变化研究廖春丽;王福梅;陈兰英;赵安芳中国调味品大蒜生长过程中SOD酶活力变化研究谢晖青海师专学报大蒜中超氧化物歧化酶提取工艺的研究原龙;王新;杨平西安工程大学学报\