饲料对异育银鲫消化道微生物物种组成的影响,渔业论文

饲料对异育银鲫消化道微生物物种组成的影响,渔业论文肠道对于动物来讲就像是内在生命线,而肠道内微生物影响着肠道诸多功能的发挥,因而关于肠道内微生物的研究最近几年也越来越被重视。已有研究表示清楚,鱼类消化道微生物对鱼的免疫、营养等都有重要影响,消化道内微生物群落的平衡稳定能够促进鱼体健康的生长。鱼类消化道微生物在影响着宿主鱼的同时,其组成也受着宿主本身与外界因素的影响,Romero等发现银大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)消化道微生物群落在第一投喂阶段后才稳定,而李学梅等对室内养殖的斑点叉尾、银鲫和异育银鲫的消化道微生物进行了比拟,发现不同种鱼的消化道微生物的种类组成有显着差异,同时尹军霞等研究发现同种鱼消化道不同区段的微生物组成也存在很大不同,另外,Margolis早在1952年用传统培养法对经过饥饿处理的大头鱼(Ameiurusnebulosus)及斑点鳟(Salaelirutsfon-tinali)的消化道细菌进行了研究,发现饥饿使消化道微生物种类减少。以上研究表示清楚消化道微生物与宿主鱼之间存在密切关系。对于外界条件变化,消化道微生物本身能否存在响应机制呢？本研究选用消化道微生物群落已相对稳定的异育银鲫中科3号成鱼作为研究对象,并将其消化道作为相对封闭的微型生态系统来研究,旨在进一步阐述饲料这一鱼类营养源在作为消化道微生态系统外界干扰时对其内部物种组成的影响,为今后研究消化道微生物功能基因指明了方向,同时为水产鱼类肠道菌群研究提供一些基础数据。1材料与方式方法1.1实验材料与样品采集实验鱼饲养于中国科学院水生生物研究所鱼类生理生态学学科组循环水系统中,水温为2428℃,期间投喂人工配合饲料,待性成熟后进行饥饿处理30d,随机抽取3尾同规格的鱼,在编号A、B和C后解剖取样,取样时用75%的酒精擦拭肠外壁,分前肠、中肠和后肠取样,获得9份样品分别编号H1-H9(H1、H2、H3代表A的前肠、中肠和后肠,H4-H6及H7-H9对应代表B和C的前肠、中肠和后肠),保存用于微生物DNA的提取;再给剩下的鱼投喂一样人工配合饲料,25d后再次随机抽取3尾同规格的鱼编号D、E和F,解剖取样得9份样品,分别编号F1-F9(F1、F2、F3代表D的前肠、中肠和后肠,F4-F6及F7-F9对应代表E和F的前肠、中肠和后肠),保存用于微生物DNA的提取。1.2消化道微生物总DNA的提取实验采用传统的酚-氯仿法提取肠道微生物总DNA,即:向每管样品中参加1.2mL裂解液(0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0;100mmol/LNaCl;蛋白酶K100g/mL;RNaseA,50g/mL),37℃水浴1h后,参加PK(20mg/mL)6L,55℃过夜(12h,至清亮);取上清液进行DNA抽提,DNA在4℃下经24h沉淀后,离心枯燥并参加100mL无菌水溶解,20℃保存备用;总DNA用0.7%的琼脂糖凝胶(含EB)进行电泳以检测提取效果。1.3PCR-DGGE分析采用细菌16SrRNA基因V3区通用引物(F357-GC和R518)对所得18个样品中的肠道细菌DNA进行PCR扩增,将扩增得产物进行DGGE分析,变性剂浓度范围为40%70%,凝胶在110V下经过12h的电泳后紫外照相,由于投喂组F5和F6没有能得到相应的PCR扩增产物,样品F5和F6不介入数据分析,使用QuantityOne(Bio-RadLaboratories,CA,USA)软件对谱带进行分析。1.4数据分析在得到各泳道及谱带亮度等具体信息并转化为0/1矩阵后,使用Canoco4.5对数据进行CA(Cor-respondenceAnalysis)分析,通过R3.0.0对各泳道数据进行基于Jaccard指数的类似性分析并绘制聚类图,通过MicrosoftExcel2018对谱带数量及亮度值进行分析并绘图,同时计算谱带亮度值的方差值以比拟两组中各物种分布密度的变异程度大小。2结果2.1消化道微生物群落PCR-DGGE指纹分析针对细菌16SrRNA基因进行的PCR-DGGE指纹分析共检测到23条不同的谱带(图1),华而不实饥饿组谱带数为18条,投喂组谱带数为17条,两组共有谱带12条,由图上能够看出饥饿组特异性谱带稳定且与投喂组存在明显差异不同,以实验鱼为操作单元，基于全肠微生物种类分布的类似性聚类分析表示清楚(图2),饥饿组A、B和C聚为一枝,D、F聚为一枝。【图略】2.2消化道微生物群落构造类似性CA结果显示除样品F9外,投喂组(F1-F4,F7,F8)与饥饿处理组(H1-H9)消化道存在明显差异,投喂组样品主要存在于第二、三象限,饥饿组主要存在于第一象限,且投喂组各样品总体聚集较饥饿组更严密(图3),表示清楚投喂组各样品间消化道微生物群落种类组成类似性高于饥饿组;为了更直观的显示各消化道微生物群落的差异不同,基于Jaccard指数类似性聚类结果显示除F1、F2样品外,饥饿组和投喂组大部分分别聚为两大枝(图4)。【图3-4】2.3消化道微生物群落构造比拟对两组样品中的各个谱带进行比拟显示,饥饿组拥有谱带数为18,投喂组拥有谱带数为17,两对照组共同拥有谱带B3、B4、B8、B9、B10、B12、B13、B15、B18、B19、B20和B22,共计12条(图5);华而不实B3、B13、B15和B20在饥饿组和投喂组中出现频率较高,分别为77.8%与100%、100%与71.4%、77.8%与57.1%、77.8%与71.4%,属高频率共有谱带;结果还显示,饥饿组中不存在的谱带为B11、B14、B16、B17和B21,投喂组中不存在的条带为B1、B2、B5、B6、B7和B23,两者存在明显差异。【图5】为更清楚明晰的了解两组中各谱带的存在以及分布情况,我们计算并比拟了两对照组中各条带的平均亮度,结果显示(图6),投喂组56.5%的谱带平均亮度大于饥饿组,且投喂组中最大亮度与最小亮度之差(2901.99)远大于饥饿组最大亮度与最小亮度之差(1508.55);对两组方差值进行计算,结果显示,饥饿组方差值(365.79)小于投喂组方差值(885.67),表示清楚饥饿组各样品间各微生物分布密度的变异程度小于投喂组。【图6】3讨论鱼类消化道作为一个微型生态系统,其内部生活的微生物对营养物质有适应性反响,同时鱼类肠道的生物性构造差异为生活于其内的微生物造就了不同的生境,这对其内微生物分布以及扩散有很大的影响。对同一种鱼来讲,成鱼的消化道较幼鱼的消化道内环境稳定,遭到水中微生物以及温度等的影响较幼鱼的小。因而,本研究选用成鱼消化道作为研究肠道微型生态系统的对象,以饲料作为这一微型生态系统的干扰具有很高的可行性。异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)自1985年由中国科学院水生生物研究所育成以来,迅速被诸多养殖户以及群众接受,而中科3号品系当前已成为为我们国家大宗水产养殖品种,对该鱼的研究具有很好的实际意义。基于前人的探寻求索,本研究选用了异育银鲫成鱼作为研究对象,用饲料作为干扰因素以探寻求索消化道这一微型生态系统中微生物群落对恢复饲料投喂的响应机制。本研究发现充分饥饿后恢复投喂导致肠道微生物发生明显变化,首先是肠道微生物种类数量下降,并且CA分析显示投喂组样品间微生物群落物种组成类似性高于饥饿组,然而Manuel等以为,在宏观生态系统中,更多的能量来源能够支持更多的生物种群的存活,揣测本研究这一结果可能与Bitry研究有关,饲料等营养物质可在一定程度上影响前、中和后肠的差异,尽管恢复饲料投喂增加了消化道微型生态系统的能量来源,但相比于空肠,恢复投喂后,同质的饲料充满了投喂组实验鱼的肠道,在降低了实验鱼前肠、中肠、后肠的生境差异并导致微生物种类的下降,同时还使得使得各肠道样品之间的总差异减少。在分析比拟了两组条带的丰度和亮度后,发现投喂组样品平均亮度高于饥饿组样品平均亮度,表示清楚饥饿后恢复投喂使得肠道微生物总体分布密度上升。投喂组中最大亮度(B20)与最小亮度(B18)之差(2901.99)远大于饥饿组最大亮度(B13)与最小亮度(B4)之差(1508.55),且比照饥饿组方差值(365.79)与投喂组方差值(885.67)表示清楚投喂组肠道样品中微生物的种间密度差异远大于饥饿组,揣测该结果与Kamada等研究有关。Kamada等用小鼠研究表示清楚消化道微生物物种间存在生存竞争关系;本实验饲料的恢复投喂在增加了能量来源并使得微生物数量增加的同时,还使得微生物种间竞争加剧,加速构成优势种并导致各微生物密度向两极分化,微生物物种间竞争强度的增加使得有限的生境内能包容的微生物种类数量减少,这一结果在宏观生态系统研究中也得到证实。伴随着B20密度在投喂后急剧增加以及B1、B2、B5、B6、B7和B23这五个低亮度条带的消失,新出现了B11、B14、B16、B17和B21这五个条带平均亮度较高的谱带,其代表的是肠道内物种的更替,揣测其与饲料中携带的微生物有关。以上研究结果表示清楚,充分饥饿后恢复投喂会导致肠道微生物发生明显变化,本实验以恢复投喂饲料作为这一微型生态系统的外界干扰,在其带入新的微生物同时,使得微生物密度增加并导致种间竞争加剧,讲明在鱼类消化道中存在一个完好的微型生态系统。本研究为下一步研究这一现象作用机制能否与微生物或鱼肠道本身的功能基因有关指明了方向,也为研究鱼类肠道内具有特定功能的菌群奠定了基础。以下为参考文献:[1]MuellerK,AshC,PennisiE,etal.Thegutmicrobiota[J].Science,2020,336:1245[2]GmezGD,BalczarJL.Areviewontheinteractionsbetweengutmicrobiotaandinnateimmunityoffish[J].FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology,2008,52:145154[3]LXR,XiaoKY.Researchofintestinalfloraoffish[J].JiangxiFisherySciences,2008,2:1218[吕欣荣,肖克宇.鱼类肠道菌群的研究现