丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书教程文件

资料收集于网络，如有侵权请联系网站删除资料收集于网络，如有侵权请联系网站删除wordword可编辑丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书目的采用PCR测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。职责操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。专业组组长各方面工作。实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。原理采用荧光PCR光探针，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。样本要求适用标本类型：血清标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2m，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂，室温放置30-60min离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。标本保存和运送-203本应避免反复冻融。标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过4天。拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。仪器和试剂设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。试剂生产厂家：中ft大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国7271-2013最低检出量：最低检出量为500IU/ml试剂各组分见表1：组分名表1 试剂盒组分表称规格数量RNA提取液A200ul/管1核酸提取试剂RNA提取液B5ml/瓶2DEPCH2O3ml/瓶1HCV内标溶液100ul/管1PCR检测试剂HCV反应液A270ul/管1HCV反应液B30ul/管1阴性质控品200ul/管1质控品HCV强阳性质控品200ul/管1HCV临界阳性质控品200ul/管1操作步骤试剂准备（试剂储存和准备区）相应记录。PCR反应液配制取出HCV反应液AHCV反应液AB离心数秒后使用。取出N个=+4个HCV+HCV+HCV空白孔）PCR反应管，HCV2：表2 PCR反应液配置表组分组分HCV反应液AHCV反应液B总体积用量/人份27ul3ul30ul30ul分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。75%2.25mlDEPCH6.75ml75%醇，盖紧盖子，经传递窗传递到标本制备区。RNA提取（标本制备区）进入标本制备区，从传递窗中取出PCR75%乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。RNA提取液ARNA提取液B和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。65℃，使仪器自动升温。用镊子夹取n1.5ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上（n=+3=数+HCV+HCV阴性质控品）10ul200ul样本，800ulRNA提取液B，15s5min（1min5s，使裂解更充分，处理结束后瞬）200ul15s20ulRNA提取液A，漩涡振荡混匀5s，室温静置1min。8000rpm离心1min，小心吸弃上清。再加入200ulRNA提取液B，盖紧管盖，充分混匀（用移液枪吹打，室温下8000rpm1min，小心吸弃上清。75%400ul充分混匀，8000rpm1min，小心吸弃上清。75%400ul充分混匀，8000rpm1min，小心吸弃上清。打开管盖，5min，使液体挥发完全。5min50ulDEPC1min后，8000rpm1min-707.2.13取出已分装好的PCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括待测标本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）20ul，空白对照不加8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀）PCR扩增（扩增区）7.3.1从传递窗中取出PCR反应管，放入仪器样品槽内。在“Setup”按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定enamReporterDye：。AB7500核酸扩增仪标准作业指导书打开“RunMethod℃15个循环；95℃5min，1个循环；94℃15s → 55℃ 45s（收集荧光），45个循环；保存文件，运行仪器。结果分析反应结束后，操作人员可根据实际情况自行调节BaselineStartEnd值以及ThresholdStart5-20Log图谱窗口设置的ThresholdValueAnalysis自动获得分析结果，在Report界面查看结果，记录样本数值C。如果反应体系扩增曲线在FAMVIC检测通道有对数增长期，则判定样品的HCVRNA阴性。如果反应体系扩增曲线在VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且CT≤45，在VIC检测通道无对数增长期，则判定样品HCVRNA阳性性。质量控制每次实验均需检测阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断。试剂盒自带质控对数增长期。HCV阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，且强阳性质控品FAM测通道CT≤30，临界阳性质控品FAM。阳性定量参考品：增长曲线呈S0.97≤r≤1。室内质控每次实验应选择适当的HCVRNA质控品做室内质控。以上要求（9.19.2）需在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需从新进行。干扰因素环境中存在RNase，可降解RNA止皮屑、毛发等的RNase，实验用品需高压灭菌后使用，尽量避免污染。临床标本中内源性抑制物：血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类、等都可抑制PCR反应，标本应避免溶血、脂血、黄疸等。标本应按采集要求采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用具应鉴定合格。标本的交叉污染：操作过程中应细心认真，防止交叉污染，尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取，以及时发现交叉污染。11.1.0×102IU/ml~1.0×108IU/ml警示/危急值：HCVRNA/危急值。异常结果处理如遇HCVRNA医生联系、沟通，查找原因并采取措施，于《疑问报告发放处理记录表》中记录处理过程。如需复查，需及时保存标本。临床意义HCV感染诊断的指标，指导临床治疗。变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融，都会影响检测结果的准确。注意事项时更换手套。阳性质控品和检测样本均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。样品的处理操作应在生物安全柜内进行。所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。-2℃待用24h。操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。实验中用过的吸头请