第八章植物基因工程总结课件

第八章植物基因工程第八章植物基因工程1转基因植物将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。抗虫抗病抗逆生产药物转基因植物2第一节植物的转基因技术植物细胞培养技术植物转基因技术的基本路线转基因的受体系统外源基因导入植物的方法第一节植物的转基因技术植物细胞培养技术3一、植物转基因技术的基本路线分离目的基因将目的基因与载体连接，形成重组DNA利用细菌繁殖扩增重组DNA将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植物的细胞中筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株转基因植株大规模种植一、植物转基因技术的基本路线4三、外源基因导入植物的方法（一）DNA直接转移法化学刺激法PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙电击法基因枪法花粉通道法将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。三、外源基因导入植物的方法5（二）载体介导法Ti质粒介导的整合转化程序植物病毒介导的转染程序（略）（二）载体介导法61Ti质粒介导的整合转化程序Ti质粒的结构与功能双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。1Ti质粒介导的整合转化程序7（1）Ti质粒的图谱区整个质粒160-240kb

T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区（1）Ti质粒的图谱区8①转移DNA

T-DNA（transfer-DNA）左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成tmstmttmrT-DNA12-24kbtms的编码：合成吲哚乙酸tmr的编码：合成植物分裂素tmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱在T-DNA的两端还含有左右2个边界，长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。①转移DNAT-DNA（transfer-DNA）左边界右9②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，

进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。③Con区(regionsencodingconjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。④Ori区(originofreplication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA10第八章植物基因工程总结课件11第一步:植物受伤乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti质粒的毒性基因表达。第二步感染植物脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位第三步毒性基因（vir）表达第四步T-DNA转移单链T-DNA被切下来，整合到植物基因组中。第五步诱导冠瘿瘤T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。(2).农杆菌的感染和生存第一步:植物受伤(2).农杆菌的感染和生存12裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）能够自发地整合到植物的染色体上。能转化多种植物。强启动子

(3).Ti质粒转化的对象(4).Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）能够自发13野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少；tms和tmr基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。(5)

天然Ti质粒作载体的缺点野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；(5)天14（6）Ti质粒的改造除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成基因；除去Ti质粒的其它非必需序列，安装大肠杆菌复制子，安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。（6）Ti质粒的改造15改造后的Ti质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect改造后的Ti质粒载体模式leftrightMAMProri16(7)Ti载体的类型共整合载体（cointegratevectors）由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。双元载体（binaryvectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。(7)Ti载体的类型共整合载体（cointegratev17①pGV3850特点：外源基因不能直接插入，需要借助于pBR322质粒作为中间载体选择标记脓杆菌选择标记宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）最终受体植物的选择标记位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。①pGV385018第八章植物基因工程总结课件19外源基因插入pGV3850的过程外源基因插入pGV3850的过程20外源基因KanrpBR322土壤农杆菌含pGV3850植物组织卡那霉素筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素的土壤农杆菌外源基因表达鉴定转化插入感染pBR322与pGV3850重组整合到染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。外源基因KanrpBR322土壤农杆菌植物组织卡那霉素筛21转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物22共整合转化程序第八章植物基因工程总结课件23②双元载体（binaryvectors）能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。双元载体的结构Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（<10kb）Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）②双元载体（binaryvectors）Ti的精髓：Vir24第八章植物基因工程总结课件25双元载体的转化基因插入转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。帮助质粒（helperplasmid）受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。双元载体的转化26左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达E.coli左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源27双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒

，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆位点、两个T-DNA双元系统中的Ti具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒可在农杆菌内自主复制插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。双元系统的特点双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒，在接合后可以自主性地28第三节植物转基因技术在植物品种改良中的应用控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物产高品质产物的转基因植物第三节植物转基因技术在植物品种改良中的应用29转基因育种的程序基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品种遗传稳定性评价市场开发载体的构建农杆菌介导基因枪轰击筛选转基因育种的程序基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规30

转基因植物引发的安全事件英国Pusztai事件康奈尔大学斑蝶事件加拿大“超级杂草”事件墨西哥玉米事件中国Bt抗虫棉事件七、转基因生物潜在危害转基因植物引发的安全事件七、转基因生物潜在危害31

潜在危害转基因食品可能具有毒性;转基因食品可能产生过敏反应;抗生素标记基因可能使人和动物产生抗药性;病毒重组,发生基因重组,产生新的病毒,产生变异,或产生新病毒转基因作物的生态安全性问题转基作物本身可能演变为农田杂草潜在危害32对生态环境的影响：植物的“转基因逃逸”种苗的散失/残缺组织的再生花粉的传播对生态环境的影响：植物的“转基因逃逸”33

“转基因逃逸”造成的危害：诱发害虫和野草的抗性问题诱发基因转移跨越物种屏障诱发自然生物种群的改变基因污染食物链的破坏“转基因逃逸”造成的危害：34演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！35第八章植物基因工程第八章植物基因工程36转基因植物将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。抗虫抗病抗逆生产药物转基因植物37第一节植物的转基因技术植物细胞培养技术植物转基因技术的基本路线转基因的受体系统外源基因导入植物的方法第一节植物的转基因技术植物细胞培养技术38一、植物转基因技术的基本路线分离目的基因将目的基因与载体连接，形成重组DNA利用细菌繁殖扩增重组DNA将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植物的细胞中筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株转基因植株大规模种植一、植物转基因技术的基本路线39三、外源基因导入植物的方法（一）DNA直接转移法化学刺激法PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙电击法基因枪法花粉通道法将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。三、外源基因导入植物的方法40（二）载体介导法Ti质粒介导的整合转化程序植物病毒介导的转染程序（略）（二）载体介导法411Ti质粒介导的整合转化程序Ti质粒的结构与功能双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。1Ti质粒介导的整合转化程序42（1）Ti质粒的图谱区整个质粒160-240kb

T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区（1）Ti质粒的图谱区43①转移DNA

T-DNA（transfer-DNA）左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成tmstmttmrT-DNA12-24kbtms的编码：合成吲哚乙酸tmr的编码：合成植物分裂素tmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱在T-DNA的两端还含有左右2个边界，长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。①转移DNAT-DNA（transfer-DNA）左边界右44②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，

进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。③Con区(regionsencodingconjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。④Ori区(originofreplication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA45第八章植物基因工程总结课件46第一步:植物受伤乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti质粒的毒性基因表达。第二步感染植物脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位第三步毒性基因（vir）表达第四步T-DNA转移单链T-DNA被切下来，整合到植物基因组中。第五步诱导冠瘿瘤T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。(2).农杆菌的感染和生存第一步:植物受伤(2).农杆菌的感染和生存47裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）能够自发地整合到植物的染色体上。能转化多种植物。强启动子

(3).Ti质粒转化的对象(4).Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）能够自发48野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少；tms和tmr基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。(5)

天然Ti质粒作载体的缺点野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；(5)天49（6）Ti质粒的改造除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成基因；除去Ti质粒的其它非必需序列，安装大肠杆菌复制子，安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。（6）Ti质粒的改造50改造后的Ti质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect改造后的Ti质粒载体模式leftrightMAMProri51(7)Ti载体的类型共整合载体（cointegratevectors）由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。双元载体（binaryvectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。(7)Ti载体的类型共整合载体（cointegratev52①pGV3850特点：外源基因不能直接插入，需要借助于pBR322质粒作为中间载体选择标记脓杆菌选择标记宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）最终受体植物的选择标记位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。①pGV385053第八章植物基因工程总结课件54外源基因插入pGV3850的过程外源基因插入pGV3850的过程55外源基因KanrpBR322土壤农杆菌含pGV3850植物组织卡那霉素筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素的土壤农杆菌外源基因表达鉴定转化插入感染pBR322与pGV3850重组整合到染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。外源基因KanrpBR322土壤农杆菌植物组织卡那霉素筛56转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物57共整合转化程序第八章植物基因工程总结课件58②双元载体（binaryvectors）能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。双元载体的结构Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（<10kb）Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）②双元载体（binaryvectors）Ti的精髓：Vir59第八章植物基因工程总结课件60双元载体的转化基因插入转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。帮助质粒（helperplasmid）受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。双元载体的转化61左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达E.coli左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源62双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒

，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆位点、两个T-DNA双元系统中的Ti具有Vir基因和