植物组织培养无病毒苗培养

关于植物组织培养无病毒苗培养第一页，共八十六页，2022年，8月28日教学目的和要求

(1）了解植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义。（2）理解和掌握脱除植物病毒的原理及方法。（3）分离茎尖及培养方法。（4）掌握无毒苗木的鉴定方法。（5）掌握脱毒苗木的保存和利用方法。第二页，共八十六页，2022年，8月28日

第一节植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义

病毒之所以致病不是由于消耗细胞养分、通过毒素杀死细胞，而是利用细胞内物质繁殖，干扰细胞的代谢过程，在寄主细胞内产生一些对细胞正常功能有害的异常物质和条件，这使得植物病毒病的防治较其他植物病害防治更为困难，常给生产带来灾难的损失，被称为“植物的癌症”。第三页，共八十六页，2022年，8月28日一、植物病毒的危害植物病毒已超过600种，严重危害着农业生产。在果树、蔬菜、花卉、林木以及农作物上皆有发现。随着生产栽培时间的推移，危害越来越严重，发现的病毒种类也越来越多。第四页，共八十六页，2022年，8月28日病毒症状第五页，共八十六页，2022年，8月28日第六页，共八十六页，2022年，8月28日危害园艺植物的病毒数目第七页，共八十六页，2022年，8月28日如侵染菊花的病毒和类病毒有19种之多

如无子病毒(CAV)

潜隐病毒(CLV)B病毒(CVB)

轻斑驳病毒(CMMV)

矮化病毒(CSV)

脉斑驳病毒(CVMV)

退绿斑驳类病毒(CCMV)等第八页，共八十六页，2022年，8月28日4种病毒对草莓生产造成重大影响:

斑驳病毒（SMoV）草莓黄边病毒（SMYEV）草莓镶脉病毒（SVBV）草莓皱缩病毒（SCrV）、第九页，共八十六页，2022年，8月28日甘薯根腐病.甘薯叶点病甘薯枯萎病甘薯黑痣病第十页，共八十六页，2022年，8月28日2.病毒的特性及其侵染

多数植物病毒不经种子传播，多数以种子繁殖后代的植物，可以从轻度染病植株上采集种子，播种繁殖，不会将病毒传至下一代。（专化性强的病毒除外，如豆类病毒——由一种专化性强的蚜虫传播)可随着种子传播。）对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖的植物，一旦染病则毫无办法。母株一旦染病，病毒在其细胞内增殖，并通过插条、接穗、种薯、球根、鳞片传至下一代。通过昆虫作为媒介加速传播。第十一页，共八十六页，2022年，8月28日３.植株脱病毒的意义植物组织培养脱病毒技术是植物细胞工程的重要组成部分，脱毒种苗的生产在提高作物质量和产量方面已显示出极大潜力，良种、新品种的脱毒组培苗的大面积推广和应用，有效地解决了因病毒引起的品种退化问题。因此，植物组培脱毒技术在农业生产的科学化、现代化中具有巨大的应用价值和经济效益，还可减少农药的施用，改善生态环境条件，防止病害的蔓延与扩散，该方法已成为农业中应用最广泛的生物技术。第十二页，共八十六页，2022年，8月28日脱毒苗第十三页，共八十六页，2022年，8月28日病毒活力与温度的关系第十四页，共八十六页，2022年，8月28日

第二节脱除植物病毒的原理及方法

一、物理学方法：

X射线紫外线超短波高温

都能使病素钝化，其中以热处理最常用。第十五页，共八十六页，2022年，8月28日1.热处理脱除植物病毒的原理①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后；随植物细胞的DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。②热处理是一种物理效应，与冷处理一样，它可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。第十六页，共八十六页，2022年，8月28日（1）温汤浸渍处理法：将剪下的接穗或种植材料，在50℃左右的温水中，浸渍3-15分钟至数小时。（2）热风处理法：让盆载植物在35-40℃高温下生长发育，热处理空气温度应逐渐升高，然后达到所需温度，同时必须保持一定的湿度和光照，以后可切取处理后新长出的枝条作接穗和砧木，或将热处理与组织培养结合效果更好。热处理脱毒第十七页，共八十六页，2022年，8月28日2、愈伤组织热处理脱毒法

方法：从患病植株上取叶片(茎片、鳞片、花器亦可)进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。

常用处理温度及处理时间：温度：37-38℃时间：处理2周、4周或8周温度：50℃时间：3-15min。反复继代兼热处理，经历一定的时间(继代次数需试验)后，将热处理过的愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化。第十八页，共八十六页，2022年，8月28日果树作物：桃(无黄萎病)、苹果(花叶病)、葡萄(扇叶病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、树莓、红莓苔子、草莓等。蔬菜作物：马铃薯、番茄、菠菜。花卉植物：蔓生长春花、康乃馨、菊花等。其他植物：曼陀罗等。第十九页，共八十六页，2022年，8月28日

例：烟草愈伤组织兼热处理钝化烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)获得无病毒株效果做法：

A：从患病烟草植株上取5mm叶片培养，在MS附加IAA2mg/L+KT0.2mg/L的培养基上诱导愈伤组织。B：将其中一部分愈伤组织反复继代培养，继代培养中分别兼用25℃、30℃和37℃温度热处理8周。C：将热处理后的愈伤组织，转到MS附加IAA2mg/L+KT2mg/L的分化培养基中诱导芽分化。D：将1cm长的芽转移到MS附加IAA2mg/L+KT0.02mg/L生根培养基，诱导根分化。E：完整植株获得后，移植到无毒土壤栽培并进行鉴定。结果表明：反复继代培养可获得无病毒株。第二十页，共八十六页，2022年，8月28日3.低温处理脱除病毒菊花植株----5℃,4-7.5个月处理后进行茎尖培养,可以除去矮化病毒(CSV)和褪绿班驳病毒(CCMV),而单独的茎尖培养无此效果。第二十一页，共八十六页，2022年，8月28日

二、化学方法

使用农药是防治植物真细菌病害的主要方法，理论上讲，也应该是防治病毒的有效途径。有不少化学物质能抑制病毒复制，例如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、以及某些病毒抑制剂。如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白质、核酸合成抑制剂等。由于病毒的复制和寄主的代谢过程关系非常密切，因此，要找出既干扰病毒复制，又不影响寄主细胞正常代谢的药剂十分困难。第二十二页，共八十六页，2022年，8月28日利用这些化合物处理整株植物去病毒的效果虽不理想，但培养离体的组织、细胞和原生质体等却可能有良好效果。如在培养基中加入2—硫尿嘧啶可以除去烟草愈伤组织中的PVY病毒，加入放线菌素D可以抑制原生质体中的病毒复制等。

第二十三页，共八十六页，2022年，8月28日钝化、抑制和清除植物病毒的一些化合物第二十四页，共八十六页，2022年，8月28日

三、生物学方法

1.茎尖培养脱毒（1）茎尖培养脱毒的理论基础a、病毒在植物体内的转移是通过维营束系统完成的，在分生组织区域内没有维管束组织，病毒只能通过胞间连丝传递赶不上细胞的不断分裂和活跃的生长速度；b、在分裂旺盛的分生组织内，病毒的复制受到旺盛代谢活动的限制；c、在植物分生区域内，“病毒钝化体系”的活性较其他部位的活性高；d、茎尖分生组织内高浓度的植物内源激素可能会抑制病毒的增殖。第二十五页，共八十六页，2022年，8月28日（2）茎尖培养脱毒苗的方法在解剖镜下剥取茎尖。考虑到脱毒效果及提高成活率，一般切取0.2—0.5mm的茎尖为组织材料进行培养，不同的植物茎尖对外源激素的反应不同。茎尖大小:过大时接种易成活，但脱毒效果差，过小时难成活，但脱毒效果好。一般以带有1-2片叶原基为好，大小为为宜，超过0.5mm时，脱毒效果差。培养基:只要能使茎尖快速生长，分化快的培养基均适于脱毒。一般以MS较好，添加一定比例的细胞分裂素就行。第二十六页，共八十六页，2022年，8月28日马铃薯的芽第二十七页，共八十六页，2022年，8月28日茎尖的结构第二十八页，共八十六页，2022年，8月28日微茎尖普通茎尖第二十九页，共八十六页，2022年，8月28日马铃薯脱毒苗第三十页，共八十六页，2022年，8月28日第三十一页，共八十六页，2022年，8月28日康乃馨不同茎尖培养与康乃馨斑驳病毒的脱除情况第三十二页，共八十六页，2022年，8月28日(3)茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键①同一种病毒在不同植物体内分布部位不同。例：烟草花叶病毒(TMV)在如下植物中的荧光反应。烟草：l-4片叶原基中未见TMY特异荧光撞羽矮牵牛：一两片叶原基未见TMV特异荧光，而在三四片叶原茎中可见TMV荧光。番茄：1片叶原茎中未见TMV特异荧光。

所以在用茎尖培养脱毒时，必须认真确定病毒在植物茎尖中的分布部位，然后确定培养茎尖的大小.第三十三页，共八十六页，2022年，8月28日番茄：只能取生长锥或仅带一片叶原基的茎尖进行培养；撞羽矮牵牛：可取生长锥或带一两片叶原基的茎尖进行培养；烟草：可取带4片叶原基的茎尖进行培养。

利用茎尖培养法脱除植物病毒时，最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点(茎尖)大小的相关性，这样在取材时就方便多了。第三十四页，共八十六页，2022年，8月28日

茎原基0.05~0.08mm

茎原基带2片叶原基0.1~0.2mm

茎原基带4片叶原基0.3~0.4mm

茎原基带6片叶原基0.6~0.8mm第三十五页，共八十六页，2022年，8月28日②不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同。第三十六页，共八十六页，2022年，8月28日甘薯斑纹花叶病毒、缩叶花叶病毒：分布于1.0-2.0mm以内的茎尖中羽毛状花叶病毒：

分布于以内茎尖中马铃薯马铃薯卷叶病毒、Y病毒：分布于以内的茎尖中；

X病毒：分布于以内的茎尖

G病毒：分布于以内的茎尖

S病毒：0.2mm以下

第三十七页，共八十六页，2022年，8月28日2.愈伤组织培养脱毒植物各部位器官和组织培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。说明病毒颗粒会在愈伤组织的培养过程中逐渐消失。第三十八页，共八十六页，2022年，8月28日愈伤组织脱病毒的机理可能的原因有：①病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞增殖产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。②有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢失。③继代培养的愈伤组织容易产生抗性变异细胞，因而可能出现不带病毒的愈伤组织。但经愈伤组织产生无病毒苗的脱毒途径容易产生变异，可能导致植株丧失其原有的优良性状，当然也有可能产生有益的变异，但频率极低。第三十九页，共八十六页，2022年，8月28日3.茎尖微体嫁接脱毒先将砧木种子进行表面消毒，以后再接到1%琼脂以MS无机盐培养基培养发芽，用苗龄约2周的幼嫩实生苗作砧木。把实生苗从试管中取出，在无菌条件下切去顶部，留下1-1.5cm的上胚轴部分，将子叶和腋芽除去，把根切短至4—6cm长。从田间或温室旺盛生长的成年树剪取一小段新梢，经消毒后在超净台上用显微操作法取出仅带1-3个叶原基的茎尖约1mm大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。嫁接苗用液体滤纸桥培养基培养。成活率30%—50%，嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有两片展开的真叶。第四十页，共八十六页，2022年，8月28日苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率第四十一页，共八十六页，2022年，8月28日苹果不同取材时期对微体嫁接成功率的影响第四十二页，共八十六页，2022年，8月28日试管微体嫁接在果树方面发展最快

(1)嫁接植物不受与珠心及有性实生苗相关的幼年阶段的影响。(2)许多栽培品种通过嫁接繁殖了许多世代，因此果树研究者和种植者关于这些品种的自根苗的根冠大小、病虫害情况以及耐寒性等了解得很少。第四十三页，共八十六页，2022年，8月28日(3)茎尖组织培养繁殖结合热处理可产生无病毒植物，因此，许多研究者认为对通常采用嫁接繁殖的果树进行试管嫁接是很适宜的。(4)试管微体嫁接除了可培育无病毒植株外，还可解决难以生根的园艺植物的生根问题和进行嫁接亲和力的研究。第四十四页，共八十六页，2022年，8月28日

4.珠心胚培养脱毒

柑桔类80%以上的种类具有多胚性,而单胚占的比例很小。柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成的无性胚，称做珠心胚。因为病毒通常是经维管束的韧皮组织传播的，而珠心与维管束系统无直接联系。由珠心组织诱导产生的植株就可免除病毒的危害。第四十五页，共八十六页，2022年，8月28日①它与合子胚不同，不是受精的产物，而是由体细胞产生的，因此具有和母体相同的遗传组成；②与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组织连系，因此即使母体植株感染了病毒，珠心胚也是无毒的；③在自然条件下，珠心胚一般都不能发育成熟，只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应当是不带病毒的母体无性系。珠心胚具有3个特征第四十六页，共八十六页，2022年，8月28日5.花药培养脱毒花药培养的最初目的，是培育起源于花药内部花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。但经大量实验表明花药培养所得的植株有95%以上是能开花结果的多倍体，而且生长发育都优于母株。已证明，经愈伤组织培养出来的花药植株是不带病毒的，借此方法，不仅可快速培育出大量的无毒植株，并可省去病毒鉴定工作，对基层生产应用实为一举两得的事情。第四十七页，共八十六页，2022年，8月28日三、分离茎尖的培养情况第一种：是生长停止，接种的组织扩大，颜色逐渐变褐而枯死，这种情况大多是生长点在分离接种过程中受伤而造成的；第二种：是生长太慢，茎尖接种后颜色逐渐变绿，但不见增大，最后成绿色小点。这是由于生长素浓度偏低，或培养温度过低所造成的，如果立即转入较高浓度生长素的培养基中，或提高培养温度，即能促进茎尖生长；第四十八页，共八十六页，2022年，8月28日第三种：是生长过旺，接种后茎尖明显增大，约培养一同后即在茎尖基部产生愈伤组织，但不易见到茎尖的伸长，组织颜色也较浅。这是由于培养茎生长素浓度偏高，或光照弱，温度高而造成的。为此应将培养材料转入生长素浓度较低的培养基中，或降低温度，提高光照强度来解决。否则时间长了愈伤组织会表现生长分化能力；第四种：是生长正常、在营养、激素、温度、光照等各方面条件正常的情况下，接种的茎尖颜色逐渐变绿，基部逐渐增大，有时形成少量的愈伤组织，茎尖也逐渐伸长，培养一个月左右转入无基素的基本培养基，茎尖继续伸长，并产生根系，最后发育成完整植株。第四十九页，共八十六页，2022年，8月28日第三节无病毒植株脱毒程序一、材料准备1．选择植物种类及品种。选用生长健壮，遗传性一致的品种为材料，并探明该品种所脱除的病毒在寄主中的位置。2．了解该植物体内所具有的病毒种类及危害的程度。根据植物所带病毒种类，选择指示植物(敏感植物)。3．决定脱除病毒的方法：“茎尖培养”还是“热处理”还是“微体嫁接”。第五十页，共八十六页，2022年，8月28日二、生长点分离和培养(茎尖培养为例)

1．从罹病的植株上切取顶芽或腋芽。2．材料表面灭菌、决定灭菌药剂、浓度、时间。3．根据病毒在寄主内分布位置决定切取茎尖大小。如果热处理，那么决定热处理的温度、时间。4．接种成功率与茎形状结构有关。例马铃薯、百合生长点呈半圆形，较大、好分离。番薯、矮牵牛、香石竹呈半圆形，也比较好分离。大丽花、菊花生长点扁平、被对生叶原基夹住难分离。草莓，叶原基上生有密集茸毛，生长点埋在肉质凹形槽内，不仅难分离且容易污染。第五十一页，共八十六页，2022年，8月28日三、无病毒植物的鉴定

通过茎尖分生组织培养、热处理脱毒法、微体嫁接法而培养成的植株，不一定都是无病毒植株。当前用于病毒检测的方法有如下3种：①血清鉴定法；②生物鉴定法(敏感植物或指示植物)；③电子显微镜鉴定法。采用单一鉴定法并不十分可靠。特别是对一些特异性病毒，单一鉴定方法可靠性更差。最好三种方法同时鉴定，可以获得理想的结果。第五十二页，共八十六页，2022年，8月28日(一)指示植物鉴定法1、原理

指示植物法是利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为病毒种类鉴别的标准，也即枯斑和空斑测定法。第五十三页，共八十六页，2022年，8月28日2、指示植物两种类型一种是接种后产生系统性症状，扩展到植物非接种部位，通常没有局部明显病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑构成。常用的指示植物：千日红、曼陀罗、豇豆、心叶烟、辣椒、莨菪等。

第五十四页，共八十六页，2022年，8月28日每种病毒都有自己的敏感植物如：马铃薯病毒的敏感植物：千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼陀罗；大蒜病毒的敏感植物：藜、千日红；草莓病毒的敏感植物：威州草莓(从八倍体野生种选出)、野草莓、野红草莓等。桃红叶病毒的敏感植物：旱金莲。大丽花病毒的敏感植物：昆落阿藜、苋色藜、心叶烟、克里芙兰烟、矮牵牛、黄瓜。香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、苋色藜。菊花病毒的敏感植物：矮牵牛、豇豆。第五十五页，共八十六页，2022年，8月28日3、敏感植物鉴定病毒的方法：

A、摩擦接种法：取培养植株的叶片榨汁，将其汁用摩擦法接种到各自的敏感植物上，然后视其病斑有无，来判断是否脱除了病毒。接种后如若敏感植物叶片表现病斑，可根据病斑类型判断，还有哪种病毒没有脱除。

第五十六页，共八十六页，2022年，8月28日例：马铃薯体内各种病毒在其敏感植物上表现的症状：X病毒侵染千日红(叶片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日红(叶片呈突起枯斑)；X病毒侵染黄花烟(叶片呈花叶)；Y病毒侵染黄花烟(叶片花叶或条斑或呈明显脉绿带)；X病毒侵染心叶烟(叶片呈花叶)；Y病毒侵染心叶烟(叶片呈条斑)；P／G带毒体侵染心叶烟(叶片呈花叶)；M、Y病毒侵染毛叶曼陀罗(叶片呈枯斑)。植物汁液摩擦接种后，如使千日红叶片呈枯斑，使黄花烟、心叶烟叶片呈花叶证明，该植物体内具有马铃薯X病毒。第五十七页，共八十六页，2022年，8月28日B．嫁接法：有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。第五十八页，共八十六页，2022年，8月28日木本多年生植物及草莓等无性繁殖的草本植物通常采用嫁接接种的方法以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法为多。如草莓以对病毒敏感的欧洲草莓（野草莓）和深红莓作指示植物，从经脱毒得到的植株上仅取顶端一小叶作接穗，叶柄用刀片削成楔形，削面长8~10mm，然后迅速将接穗小叶的叶柄插入切口，用塑料绑缚接合部，嫁接后4周，若带有病毒，则在新展开的叶片、匍匐茎或老叶上会出现病征第五十九页，共八十六页，2022年，8月28日

（二）抗血清鉴定法1、基本原理：当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，在动物体内会产生一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白，即所谓“抗体”。引起形成抗体的物质(病毒或异体蛋白)称为“抗原”。第六十页，共八十六页，2022年，8月28日抗原和抗体结合，表现为很强的特异性。即由一种病毒产生的抗体，只能结合该种病毒。抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。抗原和抗体相结合的反应称为“血清反应”。第六十一页，共八十六页，2022年，8月28日2.病毒抗血清在诊断上的价值

A.病毒抗血清具有高度的专化性。即由一种病毒产生的“抗体”，只能结合该种病毒(抗原)。如由注射(感染)TMV而产生的抗体(免疫球蛋白)，只能检测TMV病毒(才可能发生血清反应)。B．由于“抗血清”法具有高度专化性，因此对于那些受感染而没有症状的带毒植物，也能诊断，故在实用上具有很高的价值。C．由于病毒与“抗血清”的“反应量”与病毒浓度成正比。只要知道其中一种浓度，可根据反应量来测定另一种的浓度。故此可以用来作病毒的定量分析。第六十二页，共八十六页，2022年，8月28日3.病毒抗血清在诊断上的局限性：A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清”。B．病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的抗原结构。C．植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。第六十三页，共八十六页，2022年，8月28日4、方法抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，包括病毒的繁殖、病叶研磨、汁液的澄清、病毒悬浮液的提纯、病毒的沉淀等过程。只有获得高纯度的抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。一般采用家兔制备抗植物病毒的抗血清，以9~24个月大小的家兔为好，注射病毒悬浮液，在家兔饥饿12h后采血，再进行抗血清的分离和吸收等过程。血清可分装在小玻璃瓶中，贮存在－15~－20℃的冰冻条件下，也可以分装在安瓶中，冷冻干燥，然后密封，有效保存。第六十四页，共八十六页，2022年，8月28日具体测定可采用沉淀反应、凝集反应、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和酶联免疫吸附试验等多种方法。第六十五页，共八十六页，2022年，8月28日酶联免疫吸附法

(enzyme1inkedimmunosorbentassay，EL工SA)酶联免疫吸附法是把抗原—抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术，它的灵敏度高，特异性强，特别是当寄主体内病毒浓度很低或同时存在病毒钝化物或抑制剂时，它的优势尤为明显，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广的一种方法。第六十六页，共八十六页，2022年，8月28日酶联免疫吸附法的原理利用以酶标记的特异抗体来指示抗原—抗体的结合，从而检出样品中的抗原。具体操作程序是：将待检植物汁液(抗原)注入酶联板(聚苯乙烯多孔微量反应板)中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶标记的特异抗体，待抗原与抗体充分反应后，洗去未与抗原结合的多余酶标记抗体，于是在固相载体酶联板表面就只留下以酶标记的抗原—抗体复合物。这时加入酶的无色底物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色产物。这一结果可用肉眼识别，也可用分光光度计对底物的降解量进行测定。第六十七页，共八十六页，2022年，8月28日血清鉴定法第六十八页，共八十六页，2022年，8月28日血清鉴定的基本方法A.玻璃片凝集法在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20-50min，然后在40-60倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。第六十九页，共八十六页，2022年，8月28日玻璃片凝集法第七十页，共八十六页，2022年，8月28日B．微量凝集试验(MAT)在培养皿底部，铺上一层火棉胶或聚乙烯醇缩甲醛薄膜，然后将抗血清、提取汁液滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆盖一层石蜡油。在20—25℃下保温，20-50min后观察。此法优点：鉴定时可以完全避免蒸发，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培养皿可以鉴定几十个样品。对某些病毒(马铃薯M病毒)引起的细微病毒凝聚现象均可识别。第七十一页，共八十六页，2022年，8月28日（三）电子显微镜检查法采用电子显微镜，可以通过直接观察，检查出有无病毒存在，并可以得知有关病毒颗粒的大小、形状和结构,又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。

病毒

形态长(nm)宽（nm）

X线状51513Y线状73011A线状73011S线状65012~13M线状65012~13第七十二页，共八十六页，2022年，8月28日灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。目前运用负染和超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别病毒到属的水平。1973年，Derrick把电镜与免疫学技术相结合，建立了更为灵敏的免疫吸附电镜技术，该技术已成为植物病毒研究的一个重要手段。方法的优点第七十三页，共八十六页，2022年，8月28日(四)分子生物学方法在植物病毒鉴定中采用的分子生物学方法主要是检测病毒的核酸。一般都具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点。核酸杂交技术的原理:采用带有放射性或非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下与靶病毒的核酸单链退火形成杂交双链。通过杂交信号的检测，鉴定样本中有无相应病毒的基因。第七十四页，共八十六页，2022年，8月28日19世纪末以来，许多国家开始用聚合酶链式反应(PCR)技术检测果树病毒，并取得很好的效果。常用的有聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术，即利用已知病毒的核苷酸序列或同组病毒的相似序列区域来设计引物，将待测样品用PCR技术体外扩增DNA，扩增后的产物可进行限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNARAPD)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradegelelectrophoresis，DGGE)、单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)、探针交叉杂交等技术分析检测病毒是否存在。第七十五页，共八十六页，2022年，8月28日由于多数植物病毒核酸是RNA，在进行PCR检测前，需以RNA为模板，经逆转录生成cDNA后，再利用病毒核酸特有的序列设计的引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒存在。RNA病毒和类病毒等在寄主体内可形成双链RNA(dsRNA)，而一般情况下植物体内不存在dsRNA，因此dsRNA分析也可用于植物病毒鉴定。第七十六页，共八十六页，2022年，8月28日利用DNA杂交和荧光标记技术相结合的基因芯片技术也是植物病毒快速检测的重要发展方向。在实际应用中，为了提高检测的可靠性，往往用几种方法同时鉴定。最后选择出的无毒苗即可进行扩增繁殖，用于生产。但在无毒种苗的扩增繁殖和应用过程