植物种植资源的离体

关于植物种植资源的离体第一页，共六十页，2022年，8月28日知识要求了解植物种质离体保存的类型与特点；了解超低温保存的特点与方法；掌握植物种质低温保存的基本操作技术。第二页，共六十页，2022年，8月28日概念：

种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。

种质库：是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，它有许多个体的不同基因所组成，又称基因库。

种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统称为种质资源或遗传资源。第三页，共六十页，2022年，8月28日植物种质资源保存具体方法很多，大体可分为两大类。按保存的地理位置分为原地保存和异地保存（原生境保存和非原生境保存）。一类是原境保存，为此建立自然保护区、天然公园或就地保护处于危险或受威胁的植物；另一类是异境保存，为此需要建立各种基因库，如种子园、种植园等田间基因库及种子库、花粉库等离体基因库。第四页，共六十页，2022年，8月28日按照保存的具体方法

,品种资源的保存可分为种植保存、贮藏保存、试管保存、基因文库保存。第五页，共六十页，2022年，8月28日

1.种植保存

为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活力,并不断补充其数量，品种资源材抖须每隔一定时间播种一次，即种植保存。

在种植保存时，种植条件尽可能与原产地相似，以减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选择的影响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然杂交和人为混杂。播种和收获时取样要有代表性以免因抽样而造成遗传漂移。总之要尽可能地保持原品种或类型的遗传特点和群体结构。此外，对来自自然条件悬殊地区的品种资源，可分别在不同生态地点异地种植保存。第六页，共六十页，2022年，8月28日第七页，共六十页，2022年，8月28日

2、贮藏保存

贮藏保存就是用控制贮藏条件(主要是温度和湿度)的方法，来保持品种资源种子的生活力。

长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和干燥，通过控制种子周围环境中的温湿度，迫使种子处于代谢作用的最低限度。

贮藏保存种质资源采用种质库，种质库分三种：长期库、中期库和短期库。第八页，共六十页，2022年，8月28日第九页，共六十页，2022年，8月28日3、基因文库保存

利用DNA重组技术，将种质材料的总DNA或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个DNA片断的克隆系。

第十页，共六十页，2022年，8月28日第十一页，共六十页，2022年，8月28日野外保存植物种质资源需要大量的土地和人力资源，成本高，且易遭受各种自然灾害的侵袭。种子库只能保存正常型种子，对于顽拗型、脱水敏感的种子和有性繁殖困难的植物则无能为力，而且种子库仅能保存基因，而不能保存特定的基因型材料。第十二页，共六十页，2022年，8月28日4.种质资源的离体保存定义植物种质离体保存：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。自1975年Henshaw和Morel首次提出离体保存(conservationinvitro)植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的极度重视。第十三页，共六十页，2022年，8月28日意义：所占空间少，节省大量的人力、物力和土地；便于种质资源的交流利用；需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；避免自然灾害引起的种质丢失。第十四页，共六十页，2022年，8月28日缺点：对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；易受微生物污染或发生人为差错；多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料和分化和再生能力的降低。超低温保存可在一定程度上避免这些问题。第十五页，共六十页，2022年，8月28日常用的离体保存方法有缓慢生长保存(slowgrowthconservation)和超低温保存(cryopreservation)。前者适合中短期保存，后者用于长期保存。第十六页，共六十页，2022年，8月28日（一）缓慢生长保存缓慢生长保存是通过调节培养条件，抑制保存材料生长，实现延长继代时间，减少操作和节省劳力的保存方法。影响离体保存的因素有保存时的光照、温度、湿度、季节变化，培养基中生长调节物质，种质资源的地理分布和生态类型等，可以根据具体材料采取不同的方法来延缓其生长。第十七页，共六十页，2022年，8月28日1．降低培养温度降低培养温度是植物组织培养物缓慢生长保存最常用的方法。葡萄和草莓茎尖培养物分别在9℃和4℃下连续保存多年，每年仅需继代一次。梨试管苗在4℃下，每2年继代一次，保存后，材料田间生长正常。芋头茎培养物在9℃，黑暗条件下保存3年，仍有100%的存活率。正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。第十八页，共六十页，2022年，8月28日2．培养基中添加生长调节物质常规组织培养是在培养基中添加生长素或细胞分裂素以促进外植体的生长和发育。而试管苗种质保存添加的则是生长延缓剂或生长抑制剂来抑制保存材料的生长，延长其继代周期。离体保存常用的生长调节物质有ABA(脱落酸)、CCC(矮壮素)、PP333(多效唑)、B9(比久)、MH(青鲜素)等。ABA对草莓试管苗芽增殖的抑制作用随ABA使用浓度的增加而明显增强，且均存在显著性差异。在草莓试管苗的离体保存中，多效唑对草莓试管苗芽的分化有明显的促进作用，对草莓试管苗芽的伸长具有明显的抑制作用。

第十九页，共六十页，2022年，8月28日3．提高培养基渗透压提高培养基的渗透压可抑制培养材料的生长。最常用的方法是在培养基中加入甘露醇、醇等。这类化合物是惰性物质，不易被外植体吸收，抑制外植体生长的作用持久。其作用机理是提高培养基的渗透势负值，造成水分逆境，降低细胞扩大生长所必需的膨压，使细胞吸水困难，减弱新陈代谢，延缓细胞生长，同时细胞壁酶的活性受到抑制，生长受阻，减少了养分消耗。第二十页，共六十页，2022年，8月28日4．适宜的光照强度光因子对植物的光合作用和生长有着重要的影响。调节光照强度以达到最佳的保存效果也是种质保存经常使用的方法之一。在较弱光照条件下，培养材料由于光合作用弱，生长缓慢而利于保存。第二十一页，共六十页，2022年，8月28日5．合适的包扎物试管的包扎物也对保存材料的生长有影响，主要表现在不同的封口材料对试管中气体成分及其含量等的变化，培养基的风干、污染等有不同程度的影响。因此，选择合适的包扎物对保存效果的影响很大。辛淑英（1989）在甘薯种质的保存研究中发现，以铝箔封口保存效果最佳，保持湿度效果好，还可以防止污染，而使用棉塞时间过长容易造成污染;使用橡皮塞容易造成缺氧，使材料死亡。第二十二页，共六十页，2022年，8月28日6．培养基的营养控制植物生长发育依赖外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长缓慢，植株矮小。因此采用降低培养基中的养分水平也可有效地抑制细胞生长，达到保存的目的。如菠萝种质在不添加任何生长调节剂的1/2MS培养基中保存12个月后存活率为92.2%，小苗的平均生长量只有1cm左右；保存苗转入分化培养基后，很快恢复生长并分化出丛生芽，在同一培养基中保存18个月后仍有85.7%的存活。第二十三页，共六十页，2022年，8月28日7．降低培养环境中的氧气浓度通过降低培养材料周围的大气压力或氧含量来保存植物组织培养材料，这一想法最早是由Caplin（1959）提出的。近10年这方面的研究比较少。而权银等（1989）在柑橘种质离体保存中对不同封口材料的比较研究表明，封口材料以其透气性能影响试管内气体成分，从而影响保存效果。第二十四页，共六十页，2022年，8月28日第二节超低温保存一、超低温保存概述通常将-80℃以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液氮为冷源，使温度维持在-196℃。超低温通常指低于-80℃的低温，保存介质或容器有干冰(-79℃)、超低温冰箱(-80~-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸气相(-140℃)等，其中液氮最常用。生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于生理停顿状态，因而可使植物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存。第二十五页，共六十页，2022年，8月28日第二十六页，共六十页，2022年，8月28日超低温保存技术可极大地延长储存材料的寿命；避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变异；避免了离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害；可有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。第二十七页，共六十页，2022年，8月28日第二十八页，共六十页，2022年，8月28日二、超低温保存的研究概况1.超低温保存技术的发展低温干燥；减压；超低温自从1973年Nag等首次成功地超低温保存了胡萝卜悬浮细胞以来，国内外已对近200种植物材料进行了超低温保存。2.用于离体超低温保存的植物材料种子、胚、胚轴和体细胞胚保存常用干冻法茎尖和分生组织大多用玻璃化法或包埋脱水法第二十九页，共六十页，2022年，8月28日3.超低温保存的植物种类超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。第三十页，共六十页，2022年，8月28日超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？细胞冰冻结冰保护性脱水理论溶液的玻璃化理论三、植物超低温冻存的细胞学基础第三十一页，共六十页，2022年，8月28日细胞冰冻结冰保护性脱水理论常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。第三十二页，共六十页，2022年，8月28日溶液的玻璃化理论溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。第三十三页，共六十页，2022年，8月28日提高超低温冷冻保存的措施由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。第三十四页，共六十页，2022年，8月28日冷冻防护剂防护机理：在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。第三十五页，共六十页，2022年，8月28日常用的冷冻防护剂渗透型冷冻防护剂:多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。包括二甲基亚砜（DMSO）（极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏）甘油甘露醇脯氨酸乙二醇丙二醇第三十六页，共六十页，2022年，8月28日非渗透型冰冻保护剂:是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。常见的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingylpyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羟乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)第三十七页，共六十页，2022年，8月28日四、超低温保存的方法超低温保存的基本操作程序为：选择适宜年龄和生长状态的冷冻材料；对生物材料进行预处理，提高分裂细胞的比例和减少细胞内自由水的含量，使材料达到最适生理状态；将材料装入试管或其他保存容器中，放入冰浴中；在冰浴条件下加入0℃预冷的冷冻保护剂，冰浴放置30～45min；第三十八页，共六十页，2022年，8月28日采用不同的降温冰冻方式进行冷冻，直至最后放入液氮中，并在液氮中停留至少1h；保存后的化冻，一般采取在37～40℃温水浴中快速化冻；材料化冻后的活力鉴定，进行再培养，观察恢复生长的速度及植株的再生能力，分析冻后材料或再生植株的遗传性状。第三十九页，共六十页，2022年，8月28日1.材料的选择和预处理由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存的效果有较大的影响。一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小分生细胞的存活率高于含大量液泡的大细胞；茎尖生长点、愈伤组织等培养物，解冻后只有具有上述特征的细胞才能存活。而较大的植物材料，如茎尖、胚或试管苗等，由于高度液泡化的细胞易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。第四十页，共六十页，2022年，8月28日为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。目前主要有3种预处理方式：（1）低温锻炼激活植物体内抗寒机制（2）继代培养增加有丝分裂细胞数目（3）预培养培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质第四十一页，共六十页，2022年，8月28日2.冰冻方法降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素之一。（1）快速冰冻法将材料从0℃或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在1000℃/min以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未来得及形成结晶中心就降到了-196℃的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材料，如种子等。第四十二页，共六十页，2022年，8月28日（2）慢速冰冻法采用逐步降温的方法，以0.5～2℃/min的降温速度，从0降到-30℃，-35或-40℃，随即投入液氮，或者以此降温速度连续降温到-196℃。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、原生质体等。第四十三页，共六十页，2022年，8月28日（3）分步冰冻法此法将快速和慢速2种冰冻方法结合起来。首先用较慢的速度（0.5～4℃/min）使植物材料从0℃降至一定的预冷温度（一般为-40℃）并停留一段时间（一般10min左右），使细胞进行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。（4）逐级冰冻法植物材料经过冷冻保护剂0℃预处理后，逐级通过-10，-15，-25，-35，-40℃等，每个温度停留10min左右，然后浸入液氮。第四十四页，共六十页，2022年，8月28日（5）干燥冰冻法将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮；或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进行慢冻。只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。第四十五页，共六十页，2022年，8月28日（6）脱水冰冻法将植物材料先用含有甘油和糖类的冷冻保护剂进行渗透脱水，再置于-20～-30℃的冷藏库内冻结脱水，然后立即投入液氮中迅速冷冻。（7）玻璃化法在投入液氮前，使用高浓度的冰冻保护剂，或称之为玻璃化液，在25℃或4℃下处理一段时间（一般10～60min）。玻璃化法的主要程序为：①选择适宜的材料；②材料的预培养；③装载液处理；④在0℃或25℃下用玻璃化液（PVS2）脱水；⑤投入液氮保存；⑥保存后快速化冻；⑦去除玻璃化液；⑧材料的恢复培养。第四十六页，共六十页，2022年，8月28日（8）包埋脱水法包埋脱水法是参照人工种子技术，结合低温保存的需要，将包裹和脱水结合起来，应用于超低温保存中。包埋脱水法最早出现在法国学者保存马铃薯茎尖的研究中。（9）包埋玻璃化法为了克服玻璃化法和包埋脱水法的缺点，有人将两者的优点结合起来，建立了包埋玻璃化法。需要指出的是，尽管各种冷冻方法各有自己的优缺点，但目前为止还没有一种方法普遍适用于所有的植物材料，所以必须根据不同材料来确定冷冻方法。

第四十七页，共六十页，2022年，8月28日3.化冻和洗涤目前，多数研究采用快速化冻的方式，即将保存后的外植体材料在25～40℃的水浴中化冻1～2min，材料迅速通过冰晶生长区（-60～-40℃)，从而避免了细胞再次结冰而造成的伤害。在一些研究中，采用室温流动空气、自来水冲洗等进行材料化冻也取得了较好的效果。化冻后的材料需立即进行洗涤，以除去材料组织中高浓度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用的洗涤方法是用含浓度为1.2mol/L蔗糖的基本培养基25℃下处理10min，也有用浓度为1.5～2.0mol/L的山梨醇的培养液进行保护剂成分的洗涤。第四十八页，共六十页，2022年，8月28日4.活性检测和恢复培养冻后存活率的快速鉴定通常采用FAD荧光双醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)还原法、Evans(伊凡蓝)法等。这些方法均以细胞内某些酶的活力检测为标准，不能完全表征细胞与组织的再生能力。因此冻存后材料的活力不能仅以此衡量。此外，染色法都要破坏材料来检测。由此，出现了一种不破坏材料，通过检测材料产生挥发性碳氢化合物如乙烯、乙烷等含量的方法。第四十九页，共六十页，2022年，8月28日冻后再培养虽然费时较长，却是检验材料存活率的最可靠方法。通常将茎尖洗涤后，接种到恢复培养基7-15d后转入正常培养，1周统计存活率，1个月统计再生率。恢复培养时是否需要光照表现出物种差异。第五十页，共六十页，2022年，8月28日5.超低温保存后的遗传稳定性种质资源保存的最根本的目的是保持遗传基因的稳定，控制遗传性状不发生变化。因此超低温冻存后材料的遗传特性的检测是十分必要的。Liuetal(2004)研究了超低温保存后苹果茎尖的形态学特征，并进行了同工酶分析及RAPD和AFLP分析，发现冻存材料化冻后和对照材料具有相同的再生能力，在形态学上没有差异，可溶性蛋白和POD酶也没有差异。进一步用RAPD和AFLP研究DNA水平的变化，也未发现两者有DNA水平的差异。张玉进等发现玻璃化法冻存后魔芋的遗传特性未发生改变。其他的研究结果也表明超低温保存后材料未发生染色体或DNA水平的变化，说明了超低温保存在保持种质资源遗传稳定性方面具有其他保存方法所不具有的优越性。

第五十一页，共六十页，2022年，8月28日五、影响超低温保存效果的主要因素1.材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。2.预培养和低温锻炼预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。第五十二页，共六十页，2022年，8月28日3.冰冻保护剂的应用一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。所以，生物体的低温保存离不开冰冻保护剂4.化冻方法液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。第五十三页，共六十页，2022年，8月28日5.再培养经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，再转入正常光下培养。再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。第五十四页，共六十页，2022年，8月28日六、植物种质资源超低温保存的展望建立在离体培养技术基础上的超低温保存技术，在种质资源保存中独具潜力与优势。超低温保存的材料涉及原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体细