研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性课件

Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备及其在作物中的应用研究生:陈相辉导师:王忠教授专业:植物学Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备及其在作物中的1一、研究目的和意义一、研究目的和意义2

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用ELISA测试技术，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，这些结果将有助于进一步阐明Rubisco及Rubisco活化酶的作用机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，3二、选题依据二、选题依据4Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合5创新之处本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。创新之处本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确6三、研究内容三、研究内容7Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其与光合作用的关系光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影响施氮处理对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影响Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化8试验设计流程Rubisco和Rubisco活化酶的分离提纯Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备抗体的分离与纯化利用抗体定量测定不同处理下Rubisco及Rubisco活化酶的含量

试验设计流程Rubisco和Rubisco活化酶的分离提纯9四、材料、仪器和方法四、材料、仪器和方法101、材料与仪器1.1材料

植物材料

扬麦5号动物材料新西兰大白兔1.2试剂与仪器

高速冷冻离心机液相层析收集系统垂直板电泳系统BeckmanLS-9800液体闪烁仪酶联免疫测定仪……1、材料与仪器1.1材料112、酶的提取和纯化2、酶的提取和纯化123.1免疫过程:以皮内多位点分数次注射法进行免疫首次免疫加强免疫二次免疫0.5ml抗原+0.5ml佐剂,皮内注射于兔子背部多个部位三周后，0.5ml抗原+0.5ml佐剂,皮下注射于兔子背部多个部位三周后，静脉注射0.5ml抗原检测效价一周后，耳缘静脉采血，检测抗体效价3、Rubisco及Rubisco活化酶抗体的制备3.1免疫过程:首次免疫加强免疫二次免疫0.5ml抗原+0133.2采血

用心脏取血的方法采血

3.3分离血清4℃下离心30min，除去红细胞，获得血清；或者将血液收聚在培养皿中，37℃放置6h，用吸管吸取析出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下20℃，或加0.1%NaN3或0.01%硫柳汞后，储存于4℃冰箱中。3.2采血

用心脏取血的方法采血3.3分离血清144、ELISA法测定酶含量4、ELISA法测定酶含量15Rubisco和Rubisco活化酶的定量测定

用一系列已知浓度的标准抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）与制备的Rubisco和Rubisco活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与之相比较，求得样品中抗原的含量Rubisco含量（mg·g-1FW）=[提取液（mL）+鲜叶重（g）]×稀释倍数×由标准曲线计算的Rubisco浓度/叶片鲜重Rubisco和Rubisco活化酶的定量测定165、蛋白质含量的测定依Folin-酚试剂法（薛应龙，1985）测定，以BSA作标准曲线6、光合速率和叶绿素含量的测定光合速率用便携式光合速率测定仪测定叶绿素含量用分光光度计测定5、蛋白质含量的测定依Folin-酚试剂法（薛应龙，19817五、实验进展五、实验进展181、Rubisco的提纯和纯度鉴定1、Rubisco的提纯和纯度鉴定19Rubisco的电泳图谱A为Rubisco的ND图谱B为Rubisco的SDS图谱5500014800Rubisco的电泳图谱5500014800202、小麦Rubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定2、小麦Rubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定21Rubisco活化酶的SDS图谱A为Rubisco活化酶;B为标准蛋白4500041000Rubisco活化酶的SDS图谱450004122六、研究计划1、Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备2、Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定3、C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其与光合作用的关系4、光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影响5、不同施氮水平对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影响6、Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探六、研究计划1、Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制23谢谢！谢谢！谢谢！谢谢！24Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备及其在作物中的应用研究生:陈相辉导师:王忠教授专业:植物学Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备及其在作物中的25一、研究目的和意义一、研究目的和意义26

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用ELISA测试技术，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，这些结果将有助于进一步阐明Rubisco及Rubisco活化酶的作用机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，27二、选题依据二、选题依据28Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合29创新之处本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。创新之处本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确30三、研究内容三、研究内容31Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其与光合作用的关系光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影响施氮处理对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影响Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化32试验设计流程Rubisco和Rubisco活化酶的分离提纯Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备抗体的分离与纯化利用抗体定量测定不同处理下Rubisco及Rubisco活化酶的含量

试验设计流程Rubisco和Rubisco活化酶的分离提纯33四、材料、仪器和方法四、材料、仪器和方法341、材料与仪器1.1材料

植物材料

扬麦5号动物材料新西兰大白兔1.2试剂与仪器

高速冷冻离心机液相层析收集系统垂直板电泳系统BeckmanLS-9800液体闪烁仪酶联免疫测定仪……1、材料与仪器1.1材料352、酶的提取和纯化2、酶的提取和纯化363.1免疫过程:以皮内多位点分数次注射法进行免疫首次免疫加强免疫二次免疫0.5ml抗原+0.5ml佐剂,皮内注射于兔子背部多个部位三周后，0.5ml抗原+0.5ml佐剂,皮下注射于兔子背部多个部位三周后，静脉注射0.5ml抗原检测效价一周后，耳缘静脉采血，检测抗体效价3、Rubisco及Rubisco活化酶抗体的制备3.1免疫过程:首次免疫加强免疫二次免疫0.5ml抗原+0373.2采血

用心脏取血的方法采血

3.3分离血清4℃下离心30min，除去红细胞，获得血清；或者将血液收聚在培养皿中，37℃放置6h，用吸管吸取析出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下20℃，或加0.1%NaN3或0.01%硫柳汞后，储存于4℃冰箱中。3.2采血

用心脏取血的方法采血3.3分离血清384、ELISA法测定酶含量4、ELISA法测定酶含量39Rubisco和Rubisco活化酶的定量测定

用一系列已知浓度的标准抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）与制备的Rubisco和Rubisco活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与之相比较，求得样品中抗原的含量Rubisco含量（mg·g-1FW）=[提取液（mL）+鲜叶重（g）]×稀释倍数×由标准曲线计算的Rubisco浓度/叶片鲜重Rubisco和Rubisco活化酶的定量测定405、蛋白质含量的测定依Folin-酚试剂法（薛应龙，1985）测定，以BSA作标准曲线6、光合速率和叶绿素含量的测定光合速率用便携式光合速率测定仪测定叶绿素含量用分光光度计测定5、蛋白质含量的测定依Folin-酚试剂法（薛应龙，19841五、实验进展五、实验进展421、Rubisco的提纯和纯度鉴定1、Rubisco的提纯和纯度鉴定43Rubisco的电泳图谱A为Rubisco的ND图谱B为Rubisco的SDS图谱5500014800Rubisco的电泳图谱5500014800442、小麦Rubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定2、小麦Rubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定45Rubisco活化酶的SDS图谱A为Rubisco活化酶;B为标准蛋白4500041000Rubisco活化