细胞器的分离技术

细胞器的分离技术 差速离心法高中生物教学中涉及两种重要生物技术：差速离心和密度梯度离心。高中生物必修一《分子与细胞》分离各种细胞器的方法介绍的是差速离心法。一、实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法(研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。二、实验步骤⑴匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。⑵分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.(一)差速离心(differentialcentrifugation)在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。

差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需经反复悬浮和过澹或低谨离心以除去未菠碎的期胞10mill]0iriin20min30min幫酶体取上清163DDg图2-1差速离心的基本过程g细胞质的可溶性战分細胞匀紫液细腕檯线粒休过澹或低谨离心以除去未菠碎的期胞10mill]0iriin20min30min幫酶体取上清163DDg图2-1差速离心的基本过程g细胞质的可溶性战分細胞匀紫液细腕檯线粒休离心加以纯化。沉淀转速x时间内容物A150gx20min完整细胞BlOOOgx20min细胞核，细胞碎片C3000gx6min叶绿体DlOOOOgx20min线粒体、溶酶体、微休E105000gxl20min微粒体F105000gx20min0.26%脱氧胆酸纳核糖体(二)密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)BliJinipIcisialaiihinsBucro^gr^diEintsiQW-s«dinvertTi:r1ifii茁雪r<-.v•]component•占屯dir)^e-i¥tir^gcompHanicnil—BliJinipIcisialaiihinsBucro^gr^diEintsiQW-s«dinvertTi:r1ifii茁雪r<-.v•]component•占屯dir)^e-i¥tir^gcompHanicnil—FRACTIONATION—*-samplestBHip%LM3rusv^jradiorit-le.g..SO7<mslewbuoyanldonsii/c&iTiUiOirioiilhi^jh