药品QC微生物实验室管理课件

药品QC微生物实验室管理药品QC微生物实验室管理1目录微生物实验室质量管理与保障USP微生物检测技术精要培养基的质量控制和规范化操作菌种管理（保藏、传代、分离和鉴定等）药品微生物检测分析方法的验证目录微生物实验室质量管理与保障2第一部分微生物实验室质量管理与保障第一部分微生物实验室3目录431概述及法规要求WHO微生物实验室管理要求实例质量管理与保障管理2微生物实验室的风险分析目录431概述及法规要求WHO微生物实验室管理要求实例4无菌检查和微生物限度检查的性质和特点药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行。药品微生物实验室管理用于指导药品微生物检验实验室的质量控制及质量保证。无菌检查和微生物限度检查的性质和特点药品微生物的检验结果受很5无菌检查和微生物限度检查的性质和特点这决定了微生物检验质量保证的高要求。

药品的无菌和微生物限度检测是指按照一定的检测程序和质量控制措施，确定要求无菌的样品中是否存有活的或者不允许存在的微生物

（定性试验——一次检出不得复试），或者确定单位（g/ml）样品中存在微生物的数量

（定量试验）无菌检查和微生物限度检查的性质和特点这决定了微生物检验质量保6相关法规和指南相关法规2010年版《中国药典》一部附录XVIIIG2010年版《中国药典》二部附录XIXQUSP36版<1117>《MICROBIOLOGICALBESTLABORATORYPRACTICES》

WHOTechnicalReportSeries,No.961,2011Annex2《WHOgoodpracticesforpharmaceuticalmicrobiologylaboratories》FDA《药品质量控制微生物实验室检查指南》相关法规和指南相关法规2010年版《中国药典》一部附录XVI7微生物实验室的风险分析人员风险人员配置不足，不能准确及时完成岗位工作。培训不足，工作人员不能按照SOP要求完成岗位工作。微生物实验室的风险分析人员风险人员配置不足，不能准确及时完8微生物实验室的风险分析环境风险环境洁净度：环境未达标，检验室环境污染导致测试结果阳性。实验室功能区设计不合理，污染无菌室。未对进入微生物实验室的人员进行限制，造成实验室污染。所用消毒剂管理不规范，未进行消毒效果验证，不能有效保证洁净区的微生物控制。微生物实验室的风险分析环境风险环境洁净度：环境未达标，检验室9微生物实验室的风险分析检测方法风险检测方法的制定不符合法规要求。检测方法未进行确认或验证。微生物实验室的风险分析检测方法风险检测方法的制定不符合法规要10微生物实验室的风险分析设备风险用于实验室的设备、仪器和其它装置未按要求进行验证和校准。用于实验室的设备、仪器和其它装置维护不足。实验室的设备、仪器和其它装置的监控未按要求进行。微生物实验室的风险分析设备风险用于实验室的设备、仪器和其它装11微生物实验室的风险分析试液及培养基风险未对供应商进行审核，不能保证试液及培养基质量。未按照要求储存条件进行储存，对试液及培养基质量产生不良影响。试液及培养基的配制未进行监控或验证，对试液及培养基质量产生不良影响。未对试液及培养基进行质量检查，不能保证试液及培养基质量。试液及培养基有效期管理不规范。微生物实验室的风险分析试液及培养基风险未对供应商进行审核，不12微生物实验室的风险分析菌种风险未对供应商进行审核，菌种质量不能保证。未按照要求储存条件进行储存，降低菌种活力。菌种操作（复苏、传代、保存）不规范，造成菌种污染和活力降低。未对保藏菌种进行质量检查，不能保证菌种的纯度及菌种特性。菌种使用有效期管理不规范。微生物实验室的风险分析菌种风险未对供应商进行审核，菌种质量不13微生物实验室的风险分析样品管理风险取样操作管理不规范，污染样品。样品传递、保存、分发不规范，对样品中微生物产生不利影响或直接导致检验结果错误（如需阴凉存放的样品，放在普通环境，导致样品变质或被污染；分发错误，理化检测的样品用于微生物检测）。物品：消毒、灭菌措施未经验证，如灭菌釜温度过高，培养基被破坏，微生物没办法真实表达出来，造成假阴性结果。消毒、灭菌后存放条件不合适或放置时间过长造成污染。微生物实验室的风险分析样品管理风险取样操作管理不规范，污染样14微生物实验室的风险分析污物处理管理风险污染物质的处理过程不适当，造成环境和人员的污染。未按操作规程处理剩余样品，特别是剧毒样品、生物样品，导致严重的环境污染，甚至对人员健康造成不良影响。（检验样品、

有毒的溶液、用过的培养基、动物实验动物及其排泄物）微生物实验室的风险分析污物处理管理风险污染物质的处理过程不适15微生物实验室的风险分析质量保证和质量控制风险实验室未制定内部质量保证和质量控制体系（如

偏差的处理、加标样品的使用、重复性检测和操作的熟练度），不能保证每天的检测结果与标准规定的一致性。微生物实验室的风险分析质量保证和质量控制风险实验室未制定内部16质量管理和保障管理5.废弃物的处理6.检测报告7.样品8.检测步骤1.人员2.环境3.检验方法的验证4.结果质量保证和操作质量控制9.样品操作和鉴别10.标准物质和标准培养基11.试剂和培养基12.设备微生物实验室管理质量管理和保障管理5.废弃物的处理6.检测报告7.样品8.检17WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求样品接收无级别无级别培养基制备无级别无级别灭菌前室无级别无级别灭菌后室（无菌区域内）GradeBISO5and<10cfu/m3无菌测试（操作区）GradeAISO5and<1cfu/m3无菌测试（背景区）GradeBISO5and<10cfu/m3操作区域布局-1WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求样品接收无18WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求无菌测试（隔离器）GradeAISO5and<1cfu/m3无菌测试（隔离器背景）无级别无级别培养箱无级别无级别计数区域无级别（关键步骤应在层流区域操作）无级别（关键步骤应在层流区域操作）清洁区域无级别无级别操作区域布局-2WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求无菌测试（19WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率培养箱冰箱冷库、烘箱清洁和消毒内部外部每月需要时（3个月）需要时（每年）水浴清洁、消毒、更换用水每月每6月灭菌剂消毒离心机维护清洁和消毒每年每次使用高压蒸汽灭菌器外观检查维护压力容器安全检查按照供应商要求每年（按照供应商要求）每年设备维护-1WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率培养箱清洁和消20WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率安全柜层流柜维护及机械检查每年（按照供应商要求）显微镜维护每年厌氧罐清洁和消毒每次使用培养基分配装置清洁及适当消毒每次使用螺旋震荡器清洁及消毒每次使用实验室清洁和消毒工作区域、地面清洁和消毒其它表面每次使用每3月设备维护-2WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率安全柜维护及机21WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率标准液体温度计全量程校准单点校准（通常为0点）每3年每年标准热电偶全量程校准标准温度计核对每3年每年工作温度计和工作热电偶标准温度计冰点和/或全量程核对每年湿度计校准每次使用设备校准及频率WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率标准液体温度计22WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率温控设备确认温度的稳定性和均一性温度监控每2年及维修改造后每次使用干热灭菌柜确认温度的稳定性和均一性温度监控每2年及维修改造后每次使用高压蒸汽灭菌器确认温度的稳定性和均一性温度监控每2年及维修改造后每次使用无菌测试A级区——安全柜——隔离器——性能确认——微生物监控——空气流型监控——高效过滤器完整性监控——每年及维修改造后——每次使用——每6月——每6月设备确认及监控-1WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率温控设备确认温23WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率单向层流柜——性能确认——微生物监控——空气流型监控——高效过滤器完整性监控——每年及维修改造后——每周——每6月——每6月培养基分配器体积分配检查每次调节及复位移液管体积分配精确性检查定期（依据使用频率确定）厌氧罐/培养箱厌氧指示剂检查每次使用实验室环境空气及表面微生物污染检查（通常使用空气采样器、沉降碟、接触碟、拭子）依据风险评估，建立合适的监测计划。设备确认及监控-2WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率单向层流柜——24WHO微生物实验室管理要求实例标准菌株的使用标准菌株（来源于有资质的供应商）标准储存菌株1代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用标准储存菌株2代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用标准储存菌株3代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用标准储存菌株4代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用工作菌株日常使用WHO微生物实验室管理要求实例标准菌株的使用标准菌株（来源于25第二部分USP微生物检测技术精要第二部分USP微生物26目录药典微生物章节概要非无菌制剂的微生物检查无菌测试微生物特性确定，鉴定及菌株分型目录药典微生物章节概要27微生物专家委员会的责任范围负责不负责微生物测试微生物监控水个论（除了设立微生物限度、无菌和细菌内毒素标准）微生物专家委员会的责任范围负责不负责微生物测试水28微生物学是开发、生产及成品测试的一部分无菌控制也适用于非无菌产品控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物的质量保证USP提供了每个阶段微生物控制程序和指导微生物学是开发、生产及成品测试的一部分无菌控制也适用于非无菌29作为重要组成的微生物控制原料和组分的微生物控制环境的微生物控制生产过程的微生物控制成品的微生物控制人员的微生物控制所有微生物控制的组合微生物控制作为重要组成的微生物控制原料和组分的微生物控制微生物控制30原料和组分的微生物控制的USP观点及文件<61>非无菌制剂的微生物检查：微生物计数测试<62>非无菌制剂的微生物检查：特定微生物的检验<1111>非无菌药品的微生物属性原料和组分的微生物控制的USP观点及文件原料和组分的微生物控制的USP观点及文件<61>非无菌制剂的31环境微生物控制的USP观点及文件<1116>洁净室和其他受控环境的微生物评估<1072>消毒剂与杀菌剂<1208>无菌产品包装-完整性评估环境微生物控制的USP观点及文件环境微生物控制的USP观点及文件<1116>洁净室和其他受控32过程微生物控制的USP观点及文件<1211>灭菌与无菌保证<1035>生物指示剂<1209>灭菌-化学和物理指示剂，及综合指示剂<55>生物指示剂-耐受力测试过程微生物控制的USP观点及文件过程微生物控制的USP观点及文件<1211>灭菌与无菌保证过33成品微生物控制的USP观点及文件<71>无菌测试<85>细菌内毒素测试<151>热源测试<51>抗菌有效性测试<1222>最终灭菌物品-参数放行<1207>无菌产品包装-完整性评估成品微生物控制的USP观点及文件成品微生物控制的USP观点及文件<71>无菌测试成品微生物控34微生物章节<51>防腐剂-有效性<55>生物指示剂–耐受力测试<61>非无菌产品的微生物检查：微生物测试<62>控制菌的微生物检查<71>无菌测试<85>细菌内毒素测试<1035>灭菌生物指示剂微生物章节<51>防腐剂-有效性35微生物章节<1072>消毒剂与杀菌剂<1111>非无菌产品的微生物属性<1112>水分活性应用<1116>洁净室和其他受控环境的微生物评估<1117>微生物实验室规范<1207>无菌产品包装-完整性评估微生物章节<1072>消毒剂与杀菌剂36微生物章节<1208>无菌测试-隔离系统验证<1209>无菌-化学和物理化学指示剂，及综合指示剂<1211>灭菌和无菌保证<1222>最终灭菌药品-参数放行<1223>微生物替代方法验证<1227>药物的微生物回收率验证<1229>药典物质灭菌微生物章节<1208>无菌测试-隔离系统验证37微生物章节<1231>制药用水<2021>微生物计数测试-营养和食品补充剂<2022>控制菌的微生物检查-营养和食品补充剂<2023>非无菌营养和食品补充剂的微生物评估微生物章节<1231>制药用水38非无菌制剂的微生物检查-计数方法介绍在此描述的测试允许对在需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数这些测试设计用于确定原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量标准。当用于这样的目的时，按下列指导进行，包括取样数量，结果诠释。该方法不适用于将微生物作为活性成分的产品。其它可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。非无菌制剂的微生物检查-计数方法介绍在此描述的测试允许对在需39常规过程避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）去除细菌抑制/真菌抑制性（为什么？）常规过程避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）40计数方法薄膜过滤法孔径0.45um的滤膜，选择不受样品液干扰的材质，不对微生物的截留产生影响，建议每片薄膜上的样品量为1g，过滤后适当冲洗薄膜平皿计数：平皿浇注法9cm的平皿，加入1ml样品液，15-20ml培养基，浇制温度≤45℃，每种培养基每个稀释度至少2个平皿，可使用更大规格的平皿平皿计数：表面涂布法9cm的平皿，加入45℃左右15-20ml培养基，待凝固，每种培养基每个稀释度至少2个平皿，样品涂布不少于0.1ml，可使用更大规格的平皿最大可能计数法（MPN）用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适用于霉菌计数方法薄膜过滤法孔径0.45um的滤膜，选择不受样品液干扰41生长能力测试和方法适用性生长能力测试包括：一般考虑测试菌株准备缓冲液阴性对照培养基生长测试计数方法适用性包括：样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在情况下的微生物回收率结果与解释生长能力测试和方法适用性生长能力测试包括：计数方法适用性包括42生长能力测试和方法适用性“必须建立在待测产品存在微生物情况下，仍有检出微生物能力的方法”“如果测试性能发生变化或发生可能影响测试结果的产品变更，方法适用性必须重新进行再确认”USP<61>生长能力测试和方法适用性“必须建立在待测产品存在微生物情况下43测试菌种及阴性对照微生物使用不超过5代2小时内使用，如2-8℃不超过24h黑曲霉及枯草芽孢杆菌也可制备孢子悬浮液，2-8℃保存期限需确认阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查测试菌种及阴性对照微生物使用不超过5代44培养基生长能力测试测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备得到的培养基按上述表中的条件培养TSA/TSB30-35℃，沙堡葡萄糖琼脂20-25℃细菌：3d，真菌5d结果判断：固体培养基：偏差系数为2液体培养基：有明显生长，与前次测试结果一致培养基生长能力测试测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制45计数方法的适用性计数方法适用性章节包括样品准备，接种，稀释，中和抗菌活性和在产品存在的情况下的回收率，结果和解释的方面的讨论计数方法的适用性计数方法适用性章节包括样品准备，接种，稀释，46样品制备样品制备方法依据待测产品的物理特性。如如下述的个程序均被证明不适用，必须开发适用的替代方法水溶性产品水不溶性非脂类产品脂类产品气雾剂皮肤贴剂样品制备样品制备方法依据待测产品的物理特性。如如下述的个程序47测试样品数量除非其他地方指出，用10g或10ml气雾剂：10个容器皮肤贴剂：取10片随机抽样，混合测试测试样品数量除非其他地方指出，用10g或10ml48产品检测样品培养：TAMC:30-35℃,3-5dTYMC:20-25℃,5-7d产品检测样品培养：49非无菌制剂的微生物检查-特定微生物的检验介绍样品培养下述检验方法用于在规定条件下测定指定的微生物是否存在。该测试设计用于确定一种原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量质量标准。当用于这样的目的时，按下述的指导进行，包括取样数量，结果诠释。可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。

非无菌制剂的微生物检查-特定微生物的检验介绍样品培养下述检验50常规过程常规过程避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）去除细菌抑制/真菌抑制性（为什么？）常规过程常规过程避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么51产品测试产品测试通则分别列出了各个微生物测试的章节，每个章节包括以下这些通用部分：样品制备和增殖选择性培养结果解释产品测试产品测试通则分别列出了各个微生物测试的章节，每个章节52培养基适用性测试和方法适用性测试培养基适用性测试和方法适用性测试培养基适用性测试：测试菌株准备缓冲液阴性对照生长能力测试，抑制及选择性测试方法适用性包括样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在情况下的微生物回收率结果与解释培养基适用性测试和方法适用性测试培养基适用性测试和方法适用性53菌种、阴性对照及培养基菌种、阴性对照及培养基菌种微生物使用不超过5代2小时内使用，如2-8℃不超过24h生孢梭菌也制备孢子悬浮液，2-8℃保存期限需确认阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备的培养基，根据药典确认相应培养基具有适当的特性菌种、阴性对照及培养基菌种、阴性对照及培养基菌种54质控可接受标准质控可接受标准生长能力测试液体培养基与前一批通过测试并被批准的培养基结果一致固体培养基-清楚观察到与前一通过测试并被批准的培养基的前次结果一致抑制性应无测试微生物生长指示能力菌落外观和指示反应与前一通过该测试并被批准的培养基的前次结果一致质控可接受标准质控可接受标准生长能力测试55方法适用性方法适用性如果对某个微生物的抗菌活性不能去除，那就假设这个被抑制的微生物不会出现在产品中方法适用性方法适用性如果对某个微生物的抗菌活性不能去除，那就56剂型TAMC(cfu/gorcfu/ml)TYMC(cfu/gorcfu/ml)控制菌（1g或ml）非液体口服给药制剂103102大肠埃希菌液体口服给药制剂102101大肠埃希菌直肠给药制剂103102---牙龈、皮肤、鼻及耳用102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌阴道制剂102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌白色念珠菌吸入剂102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌耐胆盐革兰阴性菌活性药物成分，辅料103102方法适用性剂型TAMCTYMC控制菌（1g或ml）非液体口服给药制57控制微生物测试控制微生物测试沙门菌大肠埃希菌铜绿假单孢菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌生孢梭菌耐胆盐G-的定性及定量没有其他的有害微生物吗？控制微生物测试控制微生物测试沙门菌没有其他的58FDA说什么无有害微生物21CFR211.113微生物污染控制（a）适当的书面程序必须建立并遵循以防止非无菌药品中的有害微生物FDA说什么无有害微生物21CFR211.113微生物污59FDA说什么还有什么？21CFR211.165分发前的测试与放行…（b）必须的话，对每批应不存在有害微生物的药品应有适当的实验室测试不仅仅是不存在USP规定的微生物FDA说什么还有什么？21CFR211.165分发前的测60有害微生物有害微生物有害微生物的概念不适合用于无菌产品，无菌产品中不得有任何微生物将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌生产环境中分离得到的微生物评估及清洁验证有害微生物有害微生物有害微生物的概念不适合用于无菌产品，无菌61有害微生物有害微生物有害微生物可以被定义为：能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响，并且由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染有害微生物有害微生物有害微生物可以被定义为：62有害微生物有害微生物显而易见的药品的有害微生物举例：在含有普通防腐剂的局部用霜剂、鼻腔喷剂或口服液中能够增殖的假单胞菌，片剂的表面生长的真菌食源性的致病细菌，如口服制剂中的沙门菌和志贺菌暴露与高湿环境中的气泡眼包装内的片剂表面会生长真菌有害微生物有害微生物显而易见的药品的有害微生物举例：63在注射剂中经常会发现下述要求：“当按待检产品无菌测试要求进行膜过滤法测试时符合要求。”各论中对无菌的通常要求在各论中另一种指出无菌测试要求的方法是什么呢？在注射剂中经常会发现下述要求：各论中对无菌的通常要求64吗啡硫酸盐注射剂：“其他要求——符合注射剂项下要求。”各论中对无菌的通常要求From<1>Injections注射剂：无菌测试-注射剂应符合无菌测试<71>的要求吗啡硫酸盐注射剂：“其他要求——符合注射剂项下要求。”各论中65美国传统的对无菌的观点：“没有细菌或其它微生物”什么是“无菌”<1211>灭菌和无菌保证中的观点“按照无菌最严格的定义，只有当样品中完全没有活的微生物时，它才能被称为是无菌的”证明产品中完全没有活的微生物，有可能吗？美国传统的对无菌的观点：“没有细菌或其它微生物”什么是“无菌66不能，除非你不准备留下产品进行销售，因为你不将整批产品进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的无菌测试的首要难点尽管批产品中有污染，但通过无菌测试的概率有多大呢？不能，除非你不准备留下产品进行销售，因为你不将整批产品进行逐67无菌测试的首要难点假设生产无菌注射剂，批量为20，000瓶，该批染菌率为0.1%，即20瓶，从20，000中随机抽取20（n）瓶进行无菌检查，检查合格的机会P为多少？P=（1-0.1%）20=98%无菌测试的首要难点假设生产无菌注射剂，批量为20，000瓶，68首要难点的推论如果你不能评估批产品中的每个产品，那根据什么判断产品的？无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。在无菌保证中将详细讨论。首要难点的推论如果你不能评估批产品中的每个产品，那根据什么判69我们现在知道不能用无菌测试合格来证明整批产品的无菌性无菌测试那么，一个产品通过无菌测试能证明什么呢？我们现在知道不能用无菌测试合格来证明整批产品的无菌性无菌测试70无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无菌保证是通过灭菌工艺或灭菌工艺的验证来得到的。无菌测试无菌测试适用于药典要求无菌的药物成分，配剂或制剂。然而，合格结果仅说明在测试条件下受检的样品中未发现微生物污染。无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无71无菌测试流程培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）去除任何抑制细菌和真菌生长的因素确定用于测试的样品数量，每个样品的用量培养样品检查测试样品是否有生长的迹象显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象必要的话再接种培养写报告无菌测试流程培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）72无菌测试：培养基测试培养基储存2-25℃无菌，密闭容器储存不超过验证的期限巯乙醇酸盐液体培养基颜色指示要求符合培养基的无菌每种要求的培养基取一部分在特定温度下培养14天，检查是否浑浊？（为什么不止一个温度？）与测试同时进行培养基的无菌检查（这样做有什么风险吗？）无菌测试：培养基测试培养基储存73无菌测试：培养基测试生长能力测试：细菌培养3天，真菌培养5天检查生长的迹象“生长”看起来是什么样的？无菌测试：培养基测试生长能力测试：74无菌测试：方法适用性测试产品特性允许的话，首选膜过滤法解释：如果生长，有浑浊产生，和对照一致。如果不是，你需要修改测试条件以去除抗菌活性如何做呢？无菌测试：方法适用性测试产品特性允许的话，首选膜过滤法75无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？每个容器中需要转移出的样品量，例如：液体（非抗生素）:装量小于1ml/瓶—所有内容物；固体：装量300mg～5g—150mg每种培养基的样品测试的数量，例如：批量大于500瓶—2%或20瓶，取少量。当一个容器的内容物足够用于两种培养基时，该测试数量可等分至两种培养基，否则按药典表中取双倍数量无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？76无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？膜过滤法时，可能的话，使用容器中所有样品直接接种法时，两种培养基中使用同样的样品，除非一个容器中的样品不够用于两种培养基无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？77无菌测试：通常的注意点无菌测试在无菌环境中进行注意避免污染的同时，注意不要影响测试对微生物的检出进行测试的工作环境应通过对工作环境取样，进行定期监控并进行适当的控制无菌测试时包括适当的阴性对照无菌测试：通常的注意点无菌测试在无菌环境中进行78无菌测试：常规方法培养条件：巯乙醇酸盐液体培养基在32.5±2.5℃培养不少于14D，TSB在22.5±2.5℃培养不少于14D，观察在14D的培养过程中定期观察培养基显微镜检查（浑浊的话，除非合理的将结果视为无效）无菌测试：常规方法培养条件：79无菌测试：结果解释只有一项或多项下列情况发生时，测试才可能被考察为无效测试：无菌测试区域的微生物环控数据显示有错误发现发现测试过程有错误阴性对照发现微生物阳性测试污染微生物鉴定后，能明确地将微生物生长归因于用于无菌测试使用的物料/技术发生错误无效测试可重新进行测试无菌测试：结果解释只有一项或多项下列情况发生时，测试才可能被80微生物特性确定，鉴定及菌株分型-概述USP35-NF302012年5月1日生效内容介绍纯培养分离初步筛选及初步确认表型微生物鉴定基因型微生物鉴定微生物鉴定方法确认生物种类史思考微生物特性确定，鉴定及菌株分型-概述USP35-NF30281何时需要进行微生物定性在下述情况中检出的微生物原料药辅料制药用水生产环境中间体成品何时需要进行微生物定性在下述情况中检出的微生物82微生物定性程度微生物特性确定微生物鉴定菌株分离微生物定性程度微生物特性确定微生物鉴定菌株分离83微生物定性程度微生物特性确定利用菌落形态学、细胞形态学，不同的染色计数，重要的诊断特性来确定实验室分离得到的微生物的特性，用于趋势分析及调查，并不是鉴定。适用于大多数非无菌生产运作及部分无菌生产环境的风险评估。微生物定性程度微生物特性确定利用菌落形态学、细胞形态学，不同84微生物定性程度微生物鉴定定义：确定实验室分离的微生物的类别，大类（如细菌，酵母菌或霉菌），小类（如属、种）。更明确的鉴定到种和属，某些方法甚至鉴定到株。当产品中的微生物数量高于制定限度或出现异常高的微生物检出率时，尤其适用。对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性及模拟工艺，如培养基灌装，失败时检出的微生物污染进行评估时是必须的。微生物定性程度微生物鉴定定义：确定实验室分离的微生物的类别，85微生物定性程度微生物鉴定<62>控制菌检测中，特别指出，当在选择性或指示培养基上发现的疑似菌落需进行确认鉴定。<1116>建议对分离得到的微生物进行适当频率的鉴定，以支持环境监测计划。对大量的非致病微生物，如葡萄球菌，棒状杆菌，微球菌，一般鉴定到属。微生物定性程度微生物鉴定<62>控制菌检测中，特别指出，当在86微生物定性程度菌株分离菌株分型是临床及公共健康微生物学中，流行病学调查的组成部分。方法包括脉冲场凝胶电泳，核糖体DNA测序，随意引物聚合酶链反应，全基因组序列限制图或光学图，用于证明微生物是相同菌株，并非常可能是同一来源。用于调查微生物的来源。微生物定性程度菌株分离菌株分型是临床及公共健康微生物学中，流87微生物定性程度菌株分离对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性或模拟工艺失败时检出的微生物污染进行评估时是必须的。<71>无菌测试允许，当测试中分离的微生物经鉴定，其生长明确归因于与物料和/无菌测试中所用到的技术相关的错误，该测试可判断为无效。微生物定性程度菌株分离对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性或88微生物鉴定步骤及方法分离纯培养初步筛选及特性确定表型微生物鉴定基因型微生物鉴定微生物鉴定步骤及方法分离纯培养89第三部分培养基的质量控制和规范化操作第三部分培养基的质量控制和规范化操作90目录培养基制备的质量控制2培养基使用规范4培养基测试33培养基的确认和接收31培养基有效期的验证35目录培养基制备的质量控制2培养基使用规范4培养基测试33培养91培养基定义培养基（Medium）是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。培养基定义培养基（Medium）是供微生物、植物组织和动物组92培养基特点培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须冷藏存放。培养基特点培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管93购置验收要求技术数据清单产品名称、编号批号使用前的pH必要的安全/危害数据有效期生产企业提供材料：产品标签购置验收要求技术数据产品名称、编号批号使用前的pH必要的安全94购置验收要求生产企业提供材料：质控证书性能评价所用测试菌株购置验收要求生产企业提供材料：质控证书性能评价所用测试菌株95购置验收要求实验室验收例行常规检查内容使用前检查(即用型培养基)购置验收要求实验室验收96培养基储存培养基的储存条件应按照供应商的要求进行。大部分培养基应储存在干燥、阴凉处，温度一般为15～25℃。部分培养基需要储存在2～8℃。培养基储存培养基的储存条件应按照供应商的要求进行。97培养基储存培养基应建立台账，至少应包括以下信息：

名称、批号、数量、规格、有效期、到货日期、验收日期、有效期、储存地点、储存条件依据“先进先出”原则进行使用。应制定开瓶的培养基的使用周期。培养基储存培养基应建立台账，至少应包括以下信息：98药典2010版，2部除附录另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行1次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。培养基制备的质量控制药典2010版，2部培养基制备的质量控制99培养基用水配制环境

器具称量

溶解培养基制备的质量控制

pH

灭菌前分装灭菌灭菌后分装

储存培养基用水培养基制备的质量控制pH100成品质量检查外观检查pH值无菌性检查促生长能力抑菌能力指示能力培养基测试成品质量检查培养基测试101外观检查外观、色泽和均一性无沉淀（一般）无气泡包装完整琼脂凝胶无裂痕无褶皱平板培养基应水平特殊要求培养基测试外观检查培养基测试102

pH值冷却至室温后测定。应与培养基说明或相关法规要求范围一致。如不符合，应进行pH值调整。培养基测试pH值培养基测试103无菌性检查无菌检查用培养基均应进行无菌性检查。用于环境监控的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中及避免出现假阳性结果。其他试验用培养基应进行预培养。培养基测试无菌性检查培养基测试104菌种菌悬液制备促生长能力抑菌能力指示能力培养基测试菌种培养基测试105培养基使用规范制备培养基的储存，注意琼脂培养基易受冷冻的影响，不宜低于0℃，凝胶结构破坏。避光、避热。琼脂培养基密封，防止水分蒸发。培养基使用规范制备培养基的储存，注意106培养基使用规范融化重复融化应被限制（不超过1次），防止过度加热或潜在污染融化时，使用水浴或流通蒸汽微波炉，热板要防止过度加热融化的培养基的储存在40-45℃水浴不应超过8h浇制平皿前擦干防止污染培养基使用规范融化107培养基使用规范-存储培养基应标示批号，制备批号制备日期，有效期培养基名称有效期确定根据成分，配方，容器，储存条件等确定生长能力试验数据支持培养基储存不得超过有效期培养基使用规范-存储培养基应标示108培养基使用规范-存储培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下

储存重要区域环控用培养基必须双重包装最终灭菌，否则进行全数预培养及用前检查应根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基培养基使用规范-存储培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的109培养基使用规范记录入库记录配置记录灭菌记录菌种使用记录培养箱使用记录培养基质量检测记录培养基配制验证报告培养基有效期验证报告培养基使用规范记录110培养基有效期的验证培养基有效期：干粉培养基未开封，按照商品说明制定。已开封，依据培养基组分性质制定，有效期应适中。外购成品培养基参考商品说明和有效期验证结论制定。培养基有效期的验证培养基有效期：111培养基有效期的验证培养基有效期：自制成品培养基平板固体培养基：有效期一般为七天未密封培养基：有效期一般为21天密封培养基：有效期最长不超过一年培养基有效期的验证培养基有效期：112培养基有效期的验证培养基有效期验证内容：外观检查pH值无菌性检查促生长能力抑菌能力指示能力培养基有效期的验证培养基有效期验证内容：113培养基有效期的验证培养基有效期验证阶段：有效期较短的培养基：两点验证：0天、有效期截止时间（可适当延长）应有验证报告有效期较长的培养基：多点验证：0天、有效期内选择验证时间点、有效期截止时间（可适当延长）验证报告定期的培养基质量检查培养基有效期的验证培养基有效期验证阶段：114第四部分菌种管理第四部分菌种管理115目录菌种管理2菌种确认4菌种复苏、传代、保藏33菌种概述31目录菌种管理2菌种确认4菌种复苏、传代、保藏33菌种概述31116菌种概述菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。标准储备菌株：由标准菌株经传代得到的培养物。工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。菌种概述菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。117菌种概述中国药典2010年版在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定实验室认可准则检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明（CNAS-CL09）USP菌种概述中国药典2010年版118菌种概述涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。CMCC提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection,ATCC)

ATCC向全球发布其获取、鉴定、保存及开发的生物标准品，推动科学研究的验证、应用及进步菌种概述涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中119菌种概述中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株ATCC的标准菌株商业派生菌株自制冷冻保藏菌株菌种概述中国医学菌种保藏ATCC的标准菌株商业派生菌株自制120为保证菌种的质量应对以下几个方面进行控制：文件管理效期管理标识管理确认管理使用管理菌种管理为保证菌种的质量应对以下几个方面进行控制：菌种管理121菌种的使用：菌种采购菌种的接受和储存菌种的复苏菌种的传代工作菌悬液的制备菌种的保存菌种的确认菌种的销毁菌种管理菌种的使用：菌种管理122实验环境应在生物安全柜中进行菌种的传代冻干保藏菌种处理用75%酒精棉消毒菌种管外壁。先用砂轮在安瓶上三分之一处划痕，再用干燥的无菌纱布包裹安瓶，最后将安瓶掰开。用无菌吸管将胰酪胨大豆肉汤培养基0.5ml左右注入被开启的菌种安瓶中吹打，使安瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。菌种复苏实验环境菌种复苏123甘油冷冻保藏菌种处理将甘油冷冻保藏菌种置于2～8℃至融化。用75%酒精棉消毒菌种管外壁。用无菌吸管混匀菌种悬液接种：用无菌吸管吸取适量菌种悬液加入到适量胰酪胨大豆肉汤培养基中，其中生孢梭菌加入到硫乙醇酸盐流体培养基中进行复苏，并做好标识。菌种复苏菌种复苏124培养：将接种好的培养基置于培养箱中进行培养。细菌于30～35℃培养18～24小时；真菌于23～28℃培养24～48小时。废弃物灭菌：将染菌的器具、试剂等浸泡消毒液，进行湿热灭菌121℃30min后废弃或清洗。菌种复苏菌种复苏125实验环境应在生物安全柜中进行菌种的传代。混匀：用无菌吸管混匀培养好的菌种复苏培养物。接种：用无菌吸管吸取适量菌种复苏培养基加入到适量的适宜胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基中。其中生孢梭菌提供厌氧环境或加入到硫乙醇酸盐流体培养基中进行传代；黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基。已接种菌种的培养基均应做好标识。菌种传代实验环境菌种传代126培养：将接种好的培养基置于培养箱中进行培养。接种于液体培养基时，细菌于30～35℃培养18～24小时；真菌于23～28℃培养24～48小时。接种于固体培养基时，细菌于30～35℃培养24～48小时；白色念珠菌于23～28℃培养48～72小时；黑曲霉于23～28℃培养5～7天。废弃物灭菌：将染菌的器具、试剂等浸泡消毒液，进行湿热灭菌121℃30min后废弃或清洗。菌种传代培养：菌种传代127保藏原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。菌种保藏保藏原理菌种保藏128保藏方式各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。菌种保藏保藏方式菌种保藏129保藏方式斜面低温保藏法甘油冷冻低温保藏法液体石蜡封藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法菌种保藏保藏方式菌种保藏130菌悬液准备取培养好的菌种传代液体培养物或刮取培养好的菌种传代固体培养物上的菌落至无菌0.9%氯化钠溶液中，并用无菌0.9%氯化钠溶液稀释至1×106～5×106CFU/ml。取经23～28℃培养5-7天的黑曲霉固体培养物，加入含0.05%吐温的无菌0.9%氯化钠溶液10ml洗下孢子，吸出转移至无菌试管作为原液，用含0.05%吐温的无菌0.9%氯化钠溶液做10倍系列稀释成1×106-5×106CFU/ml的菌悬液。菌种保藏菌悬液准备菌种保藏13110%甘油菌悬液向已制备好的菌悬液中加入等体积浓度为20%的无菌甘油溶液，得到10%甘油菌悬液。分装：将10%甘油菌悬液无菌分装至已灭菌的保存管中，每管1.0ml，并标记菌种名称、代次、编号、传代时间。保藏：将菌种保存管置于程序降温盒中，在-70℃的冰箱中保存过夜。将保存过夜的菌种保存管从程序降温盒中取出，放置于菌种专用保藏容器中，于-70℃以下保存，保藏有效期为1年。菌种保藏10%甘油菌悬液菌种保藏132菌种保藏外购的0代标准菌株复苏，1代传代，2代2代储备菌种复苏，3代传代，4代工作菌种2代储备菌种菌种保藏外购的0代标准菌株复苏，1代传代，2代2代储备菌种复133菌种确认确认要求：所有标准菌株在进行菌种保存后，应取一支保存菌种进行菌种鉴别，符合要求后方可做为标准菌株储备菌种使用。包括以下几个方面：纯培养：菌落生长情况染色镜检菌种特性检查生化试验血清学检查菌种确认确认要求：134菌种确认纯培养所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡。菌种确认纯培养135菌种确认纯培养菌种确认人员按照相应规程对菌种就进行复苏培养。如有厌氧需要，应提供厌氧环境进行培养。菌种确认人员挑取传代培养物，在适当的通用微生物培养基上用进行扇形划线分离，经过适当的培养后得到分离的纯培养单菌落。菌种鉴别人员对菌种的菌落形态进行记录，菌落形态应相似，包括但不限于菌落的隆起度、表面形态、边缘、光泽、质地、颜色、透明程度、表面菌落、深层菌落和底层菌落等，并进行拍照存档。菌种确认纯培养136菌种确认染色镜检革兰氏染色芽孢染色荚膜染色镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。菌种确认染色镜检137菌种确认菌种特性检查生化试验各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。血清学检查指抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。菌种确认菌种特性检查138菌种确认大肠埃希菌的确认菌落形态取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经30～35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。菌种确认大肠埃希菌的确认139菌种确认大肠埃希菌的确认革兰染色、镜检革兰染色：取菌落形态观察操作的培养物少许进行革兰氏染色，待干后，镜检。染色结果：革兰阴性菌呈红色。镜检结果：短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。菌种确认大肠埃希菌的确认140菌种确认大肠埃希菌的确认生化试验靛基质试验，实验结果应为阳性。甲基红试验，实验结果应为阳性。乙酰甲基甲醇生成试验，实验结果应为阳性。枸橼酸盐利用试验，实验结果应为阳性。乳糖发酵试验，实验结果应为产酸产气。菌种确认大肠埃希菌的确认141菌种确认金黄色葡萄球菌的确认菌落形态取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经30～35℃培养18～24h后，呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环,菌落直径0.7-1mm。卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1-2mm。菌种确认金黄色葡萄球菌的确认142菌种确认金黄色葡萄球菌的确认革兰染色、镜检革兰染色：取菌落形态观察操作的培养物少许进行革兰氏染色，待干后，镜检。染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色。镜检结果：为革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。生化试验血浆凝固酶试验，实验结果为血浆凝固。菌种确认金黄色葡萄球菌的确认143第五部分药品微生物检测分析方法的验证第五部分药品微生物检测分析方法的验证144微生物限度检查方法验证验证内容菌落计数控制菌检查细菌计数真菌计数大肠埃希菌白色念珠菌耐胆盐革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌梭菌金黄色葡萄球菌沙门菌微生物限度检查方法验证验证内容菌落计数控制菌检查细菌计145微生物限度检查方法验证微生物限度检查法验证包括：1.细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证

定量—回收率测定实验2.控制菌检查方法的验证

定性—能否生长、专属性实验微生物限度检查方法验证微生物限度检查法验证包括：1.细菌、146微生物限度检查方法验证平皿法最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN法）通常细菌、霉菌及酵母菌数计数方法有三种方法，即：薄膜过滤法微生物限度检查方法验证平皿法最可能数法通常细菌、霉菌及酵母菌147微生物限度检查方法验证方法的优缺点平皿法：供试品不溶或微溶，出现混浊，会干扰计数结果；由于接种量受限制，试验灵敏度受局限；操作简便，设备要求低。微生物限度检查方法验证方法的优缺点平皿法：148微生物限度检查方法验证方法的优缺点薄膜过滤法：操作复杂，设备要求高；不适用于无法溶解或粘稠度比较高的样品；可进行大体积的检验量，检验灵敏度不受局限；样品中的抑菌因素一般可被滤除；中和试剂可应用在供试品前处理或淋洗液中；分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯。微生物限度检查方法验证方法的优缺点薄膜过滤法：149微生物限度检查方法验证方法的优缺点最可能数法：

MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。微生物限度检查方法验证方法的优缺点最可能数法：150微生物限度检查方法验证供试液的制备

液体供试品；

固体、半固体或粘稠性供试品；

需用特殊方法制备供试液的供试品：非水溶性供试品；

膜剂供试品；

肠溶及结肠溶制剂供试品；气雾剂、喷雾剂供试品；贴剂供试品微生物限度检查方法验证供试液的制备液体供试品；151微生物限度检查方法验证具有抑菌活性的供试液的制备：增加稀释液或培养基体积：取规定量的供试液加入到较大量的培养基中，减少单位体积内的供试品含量，消除或降低抑菌作用。测定细菌、霉菌和酵母菌的菌数时，一般将1毫升供试液等量分注多个平皿培养计数。控制菌检查时可加大增菌培养基的使用量。微生物限度检查方法验证具有抑菌活性的供试液的制备：增加稀释液152微生物限度检查方法验证具有抑菌活性的供试液的制备：加入适宜的中和剂或灭活剂：最好在稀释剂或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。试验菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。微生物限度检查方法验证具有抑菌活性的供试液的制备：加入适宜的153微生物限度检查方法验证常见干扰物的中和剂或灭活方法微生物限度检查方法验证常见干扰物的中和剂或灭活方法154微生物限度检查方法验证具有抑菌活性的供试液的制备：增加稀释液或培养基体积、加入适宜的中和剂或灭活剂、薄膜过滤法三种方法的2种或3种联合使用。综上所述，对于具有抑菌活性的供试品，为了消除供试品的抑菌性应尽量选择操作简便、快速的方法，同时所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌活性比较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法。微生物限度检查方法验证具有抑菌活性的供试液的制备：增加稀释液155微生物限度检查方法验证菌液制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30～35℃，培养时间18～24小时，分别用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液。

将白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤，培养温度20～25℃，培养时间2～3天，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液。微生物限度检查方法验证菌液制备将大肠埃希菌、金黄色葡156微生物限度检查方法验证菌液制备将黑曲霉菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，培养温度20～25℃，培养时间5～7天，或直到获得丰富的孢子。加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。微生物限度检查方法验证菌液制备将黑曲霉菌的新鲜培养物157微生物限度检查方法验证验证程序试验组取制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu供试品对照组取制备好的供试液,以稀释液代替菌液同试验组操作菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验微生物限度检查方法验证验证程序试验组供试品对照组菌液对照158微生物限度检查方法验证验证程序平皿法-倾注法取制备好的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中,注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。微生物限度检查方法验证验证程序平皿法-倾注法159微生物限度检查方法验证验证程序平皿法-涂布法取胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，每一平皿表面接种制备好的供试液不少于0.1ml。按规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。微生物限度检查方法验证验证程序平皿法-涂布法160微生物限度检查方法验证验证程序薄膜过滤法取制备好的供试液适量，加至适量的稀释液中,混匀,过滤，用适量的冲洗液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。微生物限度检查方法验证验证程序薄膜过滤法161微生物限度检查方法验证验证程序MPN法取照制备好的试验组供试液至少3个连续稀释级，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨肉汤培养基中，同法测定菌液对照组菌数。接种管置30～35℃培养3天，逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品的原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨肉汤培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，相同条件下培养1～2天，观察是否有微生物生长。根据微生物生长的管数从检索表中查对被测供试品每1g或每1ml中总需氧菌的最可能数。微生物限度检查方法验证验证程序MPN法162微生物限度检查方法验证结果判断薄膜过滤法或平皿法：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。MPN法：试验组菌数应在菌液对照组菌数95%置信限内。验证试验至少应进行三次独立的平行实验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。若任一次试验中试验组的菌回收率不符合要求，应重新设计方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。微生物限度检查方法验证结果判断薄膜过滤法或平皿法：试验组菌163微生物限度检查方法验证控制菌检查方法的验证供试液的制备同计数方法验证时的制备方法。试验菌种包括：根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。微生物限度检查方法验证控制菌检查方法的验证供试液的制备同计164微生物限度检查方法验证菌液制备各菌液制备方法同微生物计数方法验证中菌液制备内容。生孢梭菌菌液的制备：将生孢梭菌的新鲜培养物接种至梭菌增菌培养基中，置厌氧条件下30～35℃培养48小时，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液微生物限度检查方法验证菌液制备各菌液制备方法同微生物165微生物限度检查方法验证验证方法按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中。采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征微生物限度检查方法验证验证方法按控制菌检查法取规定量供试液166微生物限度检查方法验证结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查。若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，应采用培养基稀释法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。微生物限度检查方法验证结果判断上述试验若检出试验菌，按此供167药品QC微生物实验室管理课件168药品QC微生物实验室管理药品QC微生物实验室管理169目录微生物实验室质量管理与保障USP微生物检测技术精要培养基的质量控制和规范化操作菌种管理（保藏、传代、分离和鉴定等）药品微生物检测分析方法的验证目录微生物实验室质量管理与保障170第一部分微生物实验室质量管理与保障第一部分微生物实验室171目录431概述及法规要求WHO微生物实验室管理要求实例质量管理与保障管理2微生物实验室的风险分析目录431概述及法规要求WHO微生物实验室管理要求实例172无菌检查和微生物限度检查的性质和特点药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行。药品微生物实验室管理用于指导药品微生物检验实验室的质量控制及质量保证。无菌检查和微生物限度检查的性质和特点药品微生物的检验结果受很173无菌检查和微生物限度检查的性质和特点这决定了微生物检验质量保证的高要求。

药品的无菌和微生物限度检测是指按照一定的检测程序和质量控制措施，确定要求无菌的样品中是否存有活的或者不允许存在的微生物

（定性试验——一次检出不得复试），或者确定单位（g/ml）样品中存在微生物的数量

（定量试验）无菌检查和微生物限度检查的性质和特点这决定了微生物检验质量保174相关法规和指南相关法规2010年版《中国药典》一部附录XVIIIG2010年版《中国药典》二部附录XIXQUSP36版<1117>《MICROBIOLOGICALBESTLABORATORYPRACTICES》

WHOTechnicalReportSeries,No.961,2011Annex2《WHOgoodpracticesforpharmaceuticalmicrobiologylaboratories》FDA《药品质量控制微生物实验室检查指南》相关法规和指南相关法规2010年版《中国药典》一部附录XVI175微生物实验室的风险分析人员风险人员配置不足，不能准确及时完成岗位工作。培训不足，工作人员不能按照SOP要求完成岗位工作。微生物实验室的风险分析人员风险人员配置不足，不能准确及时完176微生物实验室的风险分析环境风险环境洁净度：环境未达标，检验室环境污染导致测试结果阳性。实验室功能区设计不合理，污染无菌室。未对进入微生物实验室的人员进行限制，造成实验室污染。所用消毒剂管理不规范，未进行消毒效果验证，不能有效保证洁净区的微生物控制。微生物实验室的风险分析环境风险环境洁净度：环境未达标，检验室177微生物实验室的风险分析检测方法风险检测方法的制定不符合法规要求。检测方法未进行确认或验证。微生物实验室的风险分析检测方法风险检测方法的制定不符合法规要178微生物实验室的风险分析设备风险用于实验室的设备、仪器和其它装置未按要求进行验证和校准。用于实验室的设备、仪器和其它装置维护不足。实验室的设备、仪器和其它装置的监控未按要求进行。微生物实验室的风险分析设备风险用于实验室的设备、仪器和其它装179微生物实验室的风险分析试液及培养基风险未对供应商进行审核，不能保证试液及培养基质量。未按照要求储存条件进行储存，对试液及培养基质量产生不良影响。试液及培养基的配制未进行监控或验证，对试液及培养基质量产生不良影响。未对试液及培养基进行质量检查，不能保证试液及培养基质量。试液及培养基有效期管理不规范。微生物实验室的风险分析试液及培养基风险未对供应商进行审核，不180微生物实验室的风险分析菌种风险未对供应商进行审核，菌种质量不能保证。未按照要求储存条件进行储存，降低菌种活力。菌种操作（复苏、传代、保存）不规范，造成菌种污染和活力降低。未对保藏菌种进行质量检查，不能保证菌种的纯度及菌种特性。菌种使用有效期管理不规范。微生物实验室的风险分析菌种风险未对供应商进行审核，菌种质量不181微生物实验室的风险分析样品管理风险取样操作管理不规范，污染样品。样品传递、保存、分发不规范，对样品中微生物产生不利影响或直接导致检验结果错误（如需阴凉存放的样品，放在普通环境，导致样品变质或被污染；分发错误，理化检测的样品用于微生物检测）。物品：消毒、灭菌措施未经验证，如灭菌釜温度过高，培养基被破坏，微生物没办法真实表达出来，造成假阴性结果。消毒、灭菌后存放条件不合适或放置时间过长造成污染。微生物实验室的风险分析样品管理风险取样操作管理不规范，污染样182微生物实验室的风险分析污物处理管理风险污染物质的处理过程不适当，造成环境和人员的污染。未按操作规程处理剩余样品，特别是剧毒样品、生物样品，导致严重的环境污染，甚至对人员健康造成不良影响。（检验样品、

有毒的溶液、用过的培养基、动物实验动物及其排泄物）微生物实验室的风险分析污物处理管理风险污染物质的处理过程不适183微生物实验室的风险分析质量保证和质量控制风险实验室未制定内部质量保证和质量控制体系