分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件

RNA干扰及其它小RNA

(RNAinterference

andothersmallRNAs)RNA干扰及其它小RNA

(RNAinterferenc1BreakthroughoftheYearmiRNA----2002RNAi(siRNA)----2001BreakthroughoftheYearmiRNA-2

2006年10月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。

法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金(137万美元、107万欧元)。

RNA干扰获得诺贝尔生理学或医学奖2006年10月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委3诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息提供了基础性的依据。公报指出，RNA干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。RNA干扰机制的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒RNA进行控制。诺贝尔奖评审委员会指出，RNA干扰机制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：4“我隐约觉得是有可能获奖的。但我只有45岁，所以我想或许在一二十年内才会发生。”在接受路透社采访时，马萨诸塞大学教授克雷格·梅洛(CraigMello)如是说。

斯坦福大学教授安德鲁·法尔(AndrewFire)今年也只有47岁。“我隐约觉得是有可能获奖的。但我只有45岁，所5安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire)克雷格•梅洛(CraigC.Mello)安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire)克雷格•梅洛(Cr6RNA干扰的发现安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格•梅洛(CraigC.Mello)1998年发现了RNA干扰和基因沉默现象。其论文发表在1998年Feb19的NATRUE杂志上。FireA,XuS,MontgomeryMK,KostasSA,DriverSE,MelloCC.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.

Nature,1998,391(6669):806-811.RNA干扰的发现安德鲁•菲尔(AndrewZ.7分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件81998年2月发表于英国《自然》杂志的一篇RNA干扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价值。梅洛实验室的博士后刘棘当时在佐治亚大学攻读博士。她清楚地记得，其导师基普里奥斯(EdwardKipreos)读到那篇论文时就嘀咕，“这家伙大概会获诺贝尔奖”。

通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛仅仅等待了8年，其获奖速度之快实属罕见。1998年2月发表于英国《自然》杂志的一篇RNA9生理医学奖的评选程序大致为：卡罗琳医学院的诺贝尔大会任命一个工作委员会——诺贝尔委员会(Nobel

Committee)负责前期工作。

邀请生理医学领域的代表提名候选人，提名截至日期为每年2月1日。

诺贝尔委员会对提名进行初步筛选，然后候选人提交给诺贝尔大会。

诺贝尔大会最终决定得主，并对外公布(一般在每年10月份)。

每年12月10日在斯德哥尔摩音乐厅举行颁奖仪式。生理医学奖的评选程序大致为：卡罗琳医学院的诺贝10RNA干扰的传奇故事中心法则双链DNA——单链RNA蛋白质转录逆转录翻译反义RNARNA干扰的传奇故事中心法则转录逆转录翻译反义RNA11分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件12RNA干扰的传奇故事

很早以前，就有科学家在植物中观察到了基因“沉默”的现象。RNA干扰的传奇故事很早以前，就有科学家在13RNAi发现历程：1990年，来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！??RNAi发现历程：14事实上，不但导入的基因没有表达，而且植物本身的色素合成基因也受到某种程度的抑制，这种现象当时称为共抑制(cosuppression)。事实上，不但导入的基因没有表达，而且植物本身1594年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。

94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基16

法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干扰。实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“沉默”的17分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件18分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件19

但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。

郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃……我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁·法尔和克雷格理应获奖。”但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象20在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证21RNAi现象的普遍性

随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。

RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。RNAi现象的普遍性22PlantsC.elegansDrosophilaRNA-inducedsilencingcomplexRISCDoublestrandedRNAFungiCaplenetal.,PNAS(2001)989742Elbashiretal.,Nature(2001)411494MammalsS.pombeFireetal.,Nature(1998)391806sdsRNAprocessingRNAinterferenceNapolietal.,PlantCell(1990)2289VanderKroletal.,PlantCell(1990)2291SmallinterferingRNAs(SiRNAs)Romano&MacinoMol.Microbiol(1992)63343Volpeetal.,Science(2003)2921833Misquitta&PatersonPNAS(1999)961451Kennerdell&CarthewCell(1998)951017PlantsC.elegansDrosophilaRNA-23RNA干扰（RNAinterference，RNAi）

是指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默机制(Posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)。2006年世界科技十大新闻，2006年度诺贝尔化学与生理奖RNA干扰（RNAinterference，RNAi）24RNA干扰（RNAinterference，RNAi）

利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA,从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型的方法。（课本）RNA干扰（RNAinterference，RNAi）25RNAi作用机制RonaldPlasterk.Science2002RNAi作用机制RonaldPlasterk.Scien26基因沉默

转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)两种：

TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；

PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。基因沉默27

1998年Fire等在线虫中首次发现RNAi现象以来，陆续有报导在植物和果蝇等其他各种生物中也发现了RNAi现象但在哺乳动物细胞中，较长的dsRNA因能诱导IFN（干扰素）生成，mRNA能够发生非特异性降解，不存在特异性的RNAi现象。但在2001年，Tuschl等报导说在哺乳动物中也存在RNAi现象，介导RNAi的中间物质是双链小RNA（SmallinterferingRNA，siRNA)，只要dsRNA短于30bp，就不会促发干扰素效应，能够特异性地降解靶mRNA，导致基因沉默，这一结果开辟了RNAi现象研究与应用的新领域。1998年Fire等在线虫中首次发现RNAi现象以28RNAi的作用途径大致可分为两种：一种是以线虫、真菌和植物为代表的RdRp（RNA-dependentRNApolymerase）途径。

RNAi现象有一个靶RNA的大量产生过程，产生的靶RNA在Dicer的进一步作用下，产生大量的siRNA，达到有效浓度的siRNA能够启动RNAi机制，降解目标mRNA；RNAi的作用途径大致可分为两种：29“Transitive”RNAi.BindingofsiRNAsorshortantisenseRNAstoatargetmRNAmayprimeRNAsynthesisbyRdRPs.TheoriginalmRNAthatservedastemplateplusthecomplementaryRNAtogetherformdsRNAthatisrecognizedbyDicerandcleavedtoformsecondarysiRNAs.RdRPsinsomeorganismsmaybeabletosynthesizeRNAintheabsenceofpriming.“Transitive”RNAi.Bindingof30另一种途径以果蝇和哺乳动物细胞为代表，外源或内源的双链RNA在Dicer的切割下生成siRNA，这些siRNA与其他蛋白质形成RISC(RNA-inducedsilencingcomplex）结构，能够识别切割靶mRNA分子。

RNAi现象除了使生物体拥有抗病毒、稳定转座子和参与胚胎发育的生物学功能外，还可作为未知基因功能的逆向遗传学的研究手段。另一种途径以果蝇和哺乳动物细胞为代表，外源或内源的双31MechanisticmodelforRNAi.dsRNA,whetherendogenouslyproducedorexogenouslyprovided,iscleavedbytheATP-dependentRNaseIII-likeenzymeDicer,producing21-to25-bpsiRNAswith2-nt3′overhangs.EachsiRNArecruitsaRISC(RNA-inducedsilencingcomplex）,whichunwindsthesiRNA,exposingeachstrandforpotentialbindingtocomplementarytargetsequences.Whenthenow-activatedRISC(RISC*)bindstoatargetmRNA,itcleavesitatasiteapprox10bpfromthe5′endofthesiRNA.Thisresultsintwocleavageproducts,onemissingitspolyAtailandtheotherits5′7-methylguanosinecap,makingeachvulnerabletoadditionaldegradationbymRNAsurveillancemachinery.Meanwhile,theactivatedRISCisfreetotargetadditionalmessages.MechanisticmodelforRNAi.ds32dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程分为两步:

第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。

第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。

dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程分为两步:

33RNAi作用机制RonaldPlasterk.Science2002RNAi作用机制RonaldPlasterk.Scien34

不同的生物中Dicer的种类、数量也不同至今在哺乳动物中仅发现了一种Dicer还未找到调节Dicer功能的蛋白质DicerRNaseIII样酶不同的生物中Dicer的种类、数量也不同Dicer35RdRP(RNA-dependentRNApolymerase)最早是在一些非逆转录RNA病毒中发现以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链RNA在西红柿、拟南芥、线虫等均发现其同源物，均参与了RNAi在真核生物中未发现有特别的功能在果蝇、人未发现其同源物，但存在有发挥其作用的替代物具有识别不同RNA的能力，起到“sensor”的作用RdRP(RNA-dependentRNApolymer36The“core”RNA-silencingresponseinvolvesprocessingofthetriggerdsRNAintosmaller21-to25-bpfragmentswithdinucleotide3′overhangsbyanadenosinetriphosphate(ATP)-dependentenzymenamedDicer.DicerencodesamultidomainproteincontaininganATP-dependentRNAhelicase,PAZdomain,twotandemRNaseIIIdomains,andadsRNA-bindingdomain.The21-to25-bpproductsofDiceractivityarereferredtoasshortinterferingRNAs(siRNAs),whicharethoughttoserveas“guides”tobringnucleasemachinerytothetargetmRNA:eachsiRNAassociateswithaproteincomplexcalledRNA-inducedsilencingcomplex(RISC),andpresumablythesiRNAisunwoundbyahelicasecomponentofRISCtoallowbasepairingbetweentheantisensestrandandthetargetmRNA.SuchbasepairingleadstoendonucleolyticcleavageofthetargetmRNA,producingonefragmentmissingitspolyAtailandtheothermissingits5′7-methylguanosinecap,leavingeachsegmentvulnerabletofurtherdegradationbyRNAsurveillancemachinery.Followingcleavage,itisthoughtthatthesiRNA/RISCcomplexbecomesavailabletotargetanothermessengermolecule。The“core”RNA-silencingrespo37RISC(RNA-inducedSilencingComplex)mRNA解旋酶核酸内切酶ArgonauteproteinsiRNA？？？250KD(inactive)100KD(active)ATPRISC包含siRNA中的一条链RISC(RNA-inducedSilencingCom38RISC(RNA-inducedSilencingComplex)mRNA解旋酶核酸内切酶ArgonauteproteinsiRNA？？？250KD(inactive)100KD(active)ATPRISC包含siRNA中的一条链RISC(RNA-inducedSilencingCom39RNAi途径主要存在于细胞浆中，但是siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置尚未明确。外源性（注射或喂养）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入细胞浆中的RNAi途径，仅在细胞浆中复制的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所抑制外源性dsRNA则还可导致细胞核中的同源早期RNA转录产物减少。

RNAi途径主要存在于细胞浆中，但是siRNA产生、40BrendaBass.Nature2001长dsRNA在哺乳动物细胞会引起非特异性反应BrendaBass.Nature2001长dsRN41长dsRNA引起非特异性反应的途径PhillipSharpetal.NatureReviews2002长dsRNA引起非特异性反应的途径PhillipShar42

siRNA(smallinterferingRNA)P-AGUCCGUAACUGACUACGCUU-OHOH-UUUCAGGCAUUGACUGAUGCG-P5‘5‘3‘3‘21-23ntsiRNAThomasTuschletal，Nature2001可以在哺乳动物细胞中直接引发RNAisiRNA(smallinterferingRNA)43-----GUGAACAUCACGUACGCGGAAUACUUCGAAAUGUC-----

5’CGUACGCGGAAUACUUCGAUUUUGCAUGCGCCUUAUGAAGCU5’切割位点siRNA双链靶mRNAThomasTuschletc.Cell2002-----GUGAACAUCACGUACGCGGAAUACU44

在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹dsRNA，进而可介导RNAi，这种dsRNA可能需要转移至胞浆中才可有效地沉默同源靶mRNA。

如在果蝇中，转录含有内含子和多聚腺苷酸信号的发夹dsRNA的反向重复转基因序列比转录不含内含子、不含多聚腺苷酸信号dsRNA的转基因序列更能有效地沉默同源靶mRNA（因为内含子和多聚腺苷酸信号有利于dsRNA转移入胞浆）。在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发45

另外，内源性的小的短暂RNA（smalltemporalRNA，stRNA，为一种修饰后的miRNA）也可作为siRNA发挥基因沉默作用。

stRNA（miRNA）是约70nt发夹RNA（发夹miRNA前体，miRNAhairprecursor）被RNaseⅢ样核酸酶切割加工成的单链~22ntRNA。由于stRNA与靶基因不完全互补，它从翻译水平阻抑基因表达。另外，内源性的小的短暂RNA（smalltemp46

除上述RNAi机制外，转基因真核生物中的dsRNA尚可引起相应基因的甲基化和染色质重构、凝集、异染色质化，基因甲基化和异染色质化还可能促使异常RNA（aberrantRNA）产生，最终导致基因沉默。除上述RNAi机制外，转基因真核生物中的dsRNA47RNAi的放大效应机制

siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。

新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（randomdegradativePCR）。RNAi的放大效应机制siRNA不仅可引导RIS48分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件49RNAi的特点☆转录后水平的基因沉默☆较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。☆高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制☆可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。RNAi的特点☆转录后水平的基因沉默50其它小RNAs及其作用其它小RNAs及其作用51MicroRNAs(miRNAs):

是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。MicroRNAs(miRNAs):52MicroRNAsPasquinellietal.,Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature(2000)40886Hutvágneretal.,ACellularFunctionfortheRNA-InterferenceEnzymeDicerintheMaturationofthelet-7SmallTemporalRNA.Science(2001)293834MicroRNAsoriginallyidentifiedinC.elegansasnon-codingRNAsof~22ntsprocessedfromaprecursorRNAof~80ntswithadefinedhairpinstructure.The22ntRNAspecies(Let7)wasrequiredfordevelopmentaltimingthroughinteractionwithanothertranscriptSubsequentlytherewasevidenceforaroleforDicerproteininpre-let-7processinginvitroandinvivo.MicroRNAsPasquinellietal.,53miRNA的特征:

大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21-25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。miRNA的特征:54miRNAs的表达方式各不相同:部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（amorerestrictedspatialandtemporalexpressionpattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。miRNAs的表达方式各不相同:55miRNA的功能

对microRNAs(miRNAs)的研究正在不断增加，原因是科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（differentialspatialandtemporalexpressionpatterns），提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。miRNA的功能

对microRNAs(miR56

第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程。第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的57

bantammiRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23等。bantammiRNA是第一个被发现有原癌58在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpelfactory(car)突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。

CARPELFACTORY是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs59

对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke2003），脂肪代谢（Xu2003)和细胞分化(Kawasaki2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin2002)。对一部分miRNAs的研究分析提示：60

由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。

然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRN61miRNA和siRNA的关系

miRNA和siRNA之间的关系从表面上说，一个是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性；另一个是针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。由于每个mRNA模版可能产生很多个siRNAs，要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。miRNA和siRNA的关系

miRNA和siRNA62

然而，据推测miRNAs通常是由较大的（70­90nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的，而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，而且二者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。

然而，据推测miRNAs通常是由较大的（70­9063

在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源64未来要解决的问题

miRNAs在多个物种中广泛被发现，而且在进化上高度保守。留给我们一大堆谜团：miRNA的确切功能是什么？它的目标靶是什么？作用机制是什么？未来要解决的问题

miRNAs在多个物种中广泛65正如PhillipZamore说的：“如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能，那真是大自然拿科研人员开涮——而且是一个残酷的玩笑”。研究miRNA的新工具

随着小分子RNA日益收受到研究人员的重视，很多研究小分子RNA的新方法不断推出。正如PhillipZamore说的：“如果miR66siRNA与miRNA作用位置不同：对于siRNA（smallinterferingRNAs）而言，mRNA就是target,而且一般推荐设计siRNA时不能包含UTR区。其他的地方就可以笼统地叫off-target,靶之外.

对于miRNA（microRNAs）而言，3‘UTR区就叫target，而mRNA的CODINGREGION就是off-target。

MicroRNAsandsmallinterferingRNAscaninhibitmRNAexpressionbysimilarmechanisms--Zengetal_100(17)9779--ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences

SaxenaS,JonssonZO,DuttaA.SmallRNAswithimperfectmatchtoendogenousmRNArepresstranslation.Implicationsforoff-targetactivityofsmallinhibitoryRNAinmammaliancells.JBiolChem.2003Nov7;278(45):44312-9.Epub2003Sep2.siRNA与miRNA作用位置不同：对于siRNA（67分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件68piRNAs简介piRNAs简介69如果piRNAs研究趋势与microRNAs相似的话，那么生物界将会由这些从事piRNA未知领域研究的科学家们带来一股研究新浪潮。——洛克菲勒大学的ThomasTuschl（piRNAs的发现为2006年世界生物10大发现之一）如果piRNAs研究趋势与microRNAs相似的70piRNA简介

来自冷泉港实验室的GregoryHannon研究小组和纽约洛克菲勒大学的ThomasTuschl研究小组的研究人员发现了数千种不同的哺乳动物小分子RNA的一个新成员——piRNAs（Piwi-interacting），该种小RNA在小鼠精子发育中普遍存在，并起到了重要作用。这一研究成果公布在2006/6月4日的《Nature》网络版。piRNA简介71

自2000年RNA研究进展被Science杂志评为年度重大科技突破之后，2001年的RNAi，2002年的“SmallRNA&RNAi”，以及2003年的小核糖核酸都相继在重大科技成就上榜上有名。RNA研究风声水起，就连在DNA的传递遗传物质和蛋白的执行功能这些“专长”方面也发现是由RNA最初具有的。

自2000年RNA研究进展被Science杂志评72

piRNA，即Piwi-interactingnucleotides在之前的发育精子研究中就发现其对于合子的形成的复杂过程中势必可少的，但是它们的功能和起源仍然是不清楚的;piRNA，即Piwi-interacting73

研究人员主要的研究对象是来自无脊椎动物和小鼠中研究精子细胞发育过程中起重要作用的Piwi蛋白——这些蛋白分子组成了Argonaute家族蛋白的一个结构域，microRNA靶向Argonaute蛋白标志来使基因沉默。研究人员主要的研究对象是来自无脊椎动物和小鼠中74

两个研究小组都分别对能与小鼠睾丸组织包含Piwi蛋白的核蛋白复合体免疫共沉的RNA进行了纯化、克隆和测序。其中Tuschl和他的同事们的实验利用了Piwi蛋白的同源蛋白MILI蛋白，而冷泉港实验室的GregoryHannon则利用MIWI进行实验。结果两个研究小组都在他们的免疫共沉淀试验中发现了21-23核苷酸长度的RNA分子。Hannon小组的Northern印迹分析显示这些单链RNA与Piwi相连，而不是与其它Argonaute蛋白相连。两个研究小组将这些RNA称作Piwi-interactingnucleotides或者piRNA，并且发现与MIWI相比，MILI与稍微小一点的piRNA相结合。两个研究小组都分别对能与小鼠睾丸组织包含Pi75

两个小组发现大概90%的piRNA序列以尿嘧啶开始，与其它的小RNA分子的特点一样。Hannon和他的同事们在小鼠睾丸中发现了52,934种候选piRNAs，在人类中发现了52,099种，而在老鼠中发现了47,024种。在这些物种中，大部分piRNAs成簇形成相对少量的基因座（loci），小鼠中大约形成100个主要的基因簇。这种成簇现象表明大量的piRNA由长距离转录加工而成。两个小组发现大概90%的piRNA序列以尿嘧啶76与microRNAs和siRNAs不一样，piRNAs来源于单链RNA前体（precursor）而不是双链RNA前体。Tuschl和他的同事们认为，与近亲老鼠的基因组比较，小鼠的piRNA序列保守性良好，但是与遗传距离较远的物种相比，保守性较差。尽管如此，大部分小鼠的piRNA簇能在人和老鼠染色体上相同的位置找到。“它们就好象是染色体上某类基因的划分地界线。这强有力的说明它们可能与染色体生物学有关。”Hannon说。与microRNAs和siRNAs不一样，piRNA77PiRNAs在人内出现的丰度比小鼠小，假设piRNAs的功能是识别互补的信使RNA，也许人的RNA结合蛋白则代替了一些piRNAs的功能。RNA结合蛋白是人类基因组中最大种类的蛋白之一。两个研究小组利用northernblotting分析发现piRNAs出现在小鼠的精子细胞中，尤其是在减数分离开始时大量积聚，在成熟的精子产物中消失。“我们仅能在人类和小鼠的睾丸中发现piRNAs，它们也许在卵子的发育过程中也有表达，”Tuschl说。PiRNAs在人内出现的丰度比小鼠小，假设piRNA78“在精子细胞的减数分裂结束前，我们发现了基因转录的爆发，而在基因转录爆发前有巨大的、迅速的piRNAs最终爆发。”来自底特律韦恩州立大学的StephenKrawetz说。“有趣的是会看到piRNAs是否参与转录的调节或者RNA的存储。”

“在精子细胞的减数分裂结束前，我们发现了基因转录的爆79来自杜克大学综合癌症中心干细胞与生殖发育实验室（LaboratoryofStemCellsandGermlineDevelopment）主任林海帆教授领导的研究小组在之前研究的基础上，发现了在精子形成过程中大量表达的非编码小RNA——PIWI-interactingRNAs(piRNAs)，这说明在胞质核蛋白（cytosolicribonucleoprotein）和多核糖体片段（polysomalfractions）中MIWI与piRNAs，以及mRNA有关联。这一研究成果公布在8月24日美国国家科学院院刊PNAS杂志上。

之前冷泉港实验室及洛克菲勒大学的研究人员发表在6月4日的《Nature》网络版上提出了piRNAs的概念，他们发现了数千种不同的哺乳动物小分子RNA的一个新成员——piRNAs（Piwi-interacting），该种小RNA在小鼠精子发育中普遍存在，并起到了重要作用。来自杜克大学综合癌症中心干细胞与生殖发育实验室（L80Lin实验室在之前的文章中报道过MIWI这种鼠科PIWI家族成员在精子最初形成时是必须的——精子形成是一个roundspermatids发育成成熟精子的过程。进一步他们发现在早期精子形成的过程中，随着ploysome的增加，MIWI也越来越多出现在polysomefractions中。而且MIWI也与mRNA帽子结合复合物（mRNAcap-bindingcomplex）相关。有趣的是，MIWI不仅对piRNAs的表达过程，而且对于一些miRNAs“子集”（subset）的转录都是必须的——无论是否有Dicer的存在。这些研究成果说明了MIWI对两种不同类型的小RNA的形成和/或存在过程中扮演着一种复合的角色。Lin实验室在之前的文章中报道过MIWI这种鼠科P81分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件82分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件83ImplicationsfortheidentificationandapplicationofRNAiBasicScience(基础）RNA在基因表达调节中的中心作用RNAi在细胞对外界刺激的反应中的作用RNA和RNAi在宿主-病菌（外源核酸）的反应中的作用RoleofRNAiindiseaseinitiation,progressionandresponsetotherapyApplicationsAbiologicaltoolthatcanbeusedtotesthypothesesdrawnfromthelargeamountofgenetic,expressionandfunctionaldatanowavailable -Gene:proteinfunctiondiscoveryandanalysis -Pathway/networkanalysis -Moleculartargetidentification,validationandsynergisticinteractions -DrugDevelopment:mechanismofaction,drug/proteinrelationshipsEnableslargescalegene-phenotypeanalysisDevelopmentofnovelmodelsystemsDevelopmentofnovelRNAitherapeuticapproachesImplicationsfortheidentific84P-bodysequestration/RNAdegradationRNAiassociatedmechanismsNucleusCytoplasmExportin5DroshaDGCR8PashaDNAPrimarymiRNAPri-miRNAAAAATranscriptionPrecursormiRNAPre-miRNAProcessingIExportPre-miRNAProcessingII+ATPTranslationalblockadeTBRF:

TARRNAbindingproteinmiRNAAAAAEndogenousdsRNA

MicroRNAsAAAACleavagesiRNADICERRISCComplexFormationArgonauteProteinsdsRNAExogenousdsRNAs(invertebrates)TranscriptionalGeneSilencingandhetrochromatinmodificationP-bodysequestration/RNAiasso85RNAi在基因功能研究中的应用RNAi在基因功能研究中的应用86利用RNAi对进行单个特定基因进行功能缺失研究(knockdown)与基因敲除、反义核酸的比较

简便特异高效用量少可同时抑制多个基因是反向遗传学研究手段的革命性进展利用RNAi对进行单个特定基因进行功能缺失研究(knock87利用RNAi对模式生物进行全基因组功能缺失分析KimYong-Qu等分析了>5800个基因（约为估计的果蝇基因数目的40%）,发现了许多与果蝇心脏发育相关的基因Fraser等人用表达dsRNA文库的大肠杆菌喂食线虫，利用dsRNA引发的RNAi对基因表达的抑制作用，全面研究了线虫I号染色体上约90%的基因，通过观察RNAi后线虫表型的改变获得了大量基因功能的信息，使I号染色体上已知功能表型的基因的数目由原来的70个增加到378个利用RNAi对模式生物进行全基因组功能缺失分析KimYo88screeningstrategyinC.elegansJulieAhringeretal.methods2003useofRNAitoinhibitthefunctionof

86%ofthe19,427predictedgenesofC.elegans.identifiedmutantphenotypesfor1,722genes,abouttwo-thirdsofwhichwerenotpreviouslyassociatedwithaphenotype.screeningstrategyinC.elega89RNAi在疾病治疗中的应用RNAi在疾病治疗中的应用90抗肿瘤策略：针对肿瘤相关基因的siRNA可抑制肿瘤生长针对multidrugresistance(MDR)基因的siRNA可增加肿瘤细胞对药物的敏感性针对肿瘤血管增生、细胞粘附分子、肿瘤转移相关基因抗肿瘤策略：91分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件92分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件93分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件94通过降解特定的靶mRNA，阻断特定的信号转导通路FassiRNA用于降低肝炎的自身免疫反应引起的肝细胞损伤及纤维化直接针对病毒RNA的siRNA针对乙肝病毒mRNA的siRNA可抑制病毒复制、减少核抗原、表面抗原的产生目前仅限于培养细胞和小鼠实验针对HIV病毒基因组的siRNA可抑制病毒复制病毒性疾病针对病毒蛋白的siRNA抑制病毒对宿主细胞的感染(HIV-1coreceptorCCR5,CXCR4,gag)针对病毒受体的siRNA，抑制病毒对宿主细胞的感染(CD4)针对丙肝病毒、流感病毒mRNA的siRNA可抑制病毒复制通过降解特定的靶mRNA，阻断特定的信号转导通路Fassi95RNAi与肝炎病毒

Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPERX-siRNA和pSUPERcore-siRNA。已转染含1.3XwtHBV基因质粒载体的Huh7细胞再被X-siRNA或core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。RNAi与肝炎病毒Shlomai和Shaul设计了各96

另外，Randall等证明了针对HCVRNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍；将siRNA转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。另外，Randall等证明了针对HCVRNA的si97RNAi与其它病毒HuWY等证明了siRNA能阻抑逆转录Rous肉瘤病毒（RSV）感染脊椎动物；

Leonid等发现针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或编码病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒复制，加速清除受染细胞中的脊髓灰质炎病毒；

Jia等发现Rta-siRNA(Rta是疱疹病毒基因表达的一种起始转录因子)和ORF45-siRNA能特异阻止疱疹病毒复制。RNAi与其它病毒HuWY等证明了siRNA能阻抑98肝脏caspase-8siRNA在小鼠中可提高急性肝功能衰竭的生存率血管增生疾病VEGFsiRNA可抑制age-relatedmaculardegeneration(AMD)小鼠模型的视网膜血管增生肝脏血管增生疾病99神经系统疾病

常染色体神经系统显性遗传疾病：Huntington’sdisease(HD)、脊柱小脑共济失调

神经退行性疾病：Parkinson’sdisease2004年FDA批准了第一个RNAi治疗性实验代谢性疾病利用RNAi文库进行全基因组扫描，筛选药物靶标神经系统疾病2004年FDA批准了第一个RNAi治疗性实验代100分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件101RNA干扰技术应用于哺乳动物

细胞的研究策略在哺乳动物细胞中，长dsRNA(通常大于30bp)导入后，会启动细胞内的病毒防御机制，细胞内干扰素产生加大，RNA依赖的蛋白激酶被激活，使翻译起始因子elF2a磷酸化，致使细胞内全部蛋白合成的关闭；同时RNA酶L(RNaseL)被激活，产生非特异性mRNA的降解，最终诱导细胞凋亡。上述因素在一段时间内限制了RNAi在哺乳动物细胞中的应用。2001年Elbashir等首次采用体外合成的21ntsiRNA导入到人胚肾细胞和人宫颈癌细胞(HeLa)，观测到RNAi现象的发生。此后RNAi技术在哺乳动物细胞中的探索与应用逐渐成为研究热点。RNA干扰技术应用于哺乳动物

细胞的研究策略在哺乳102RNA干扰技术应用于哺乳动物细胞的研究策略在哺乳动物细胞中开展RNAi实验大致包括以下5个步骤：

选取目的基因；设计相应的siRNA序列；制备siRNA；siRNA转染哺乳动物细胞；RNAi效果分析。RNA干扰技术应用于哺乳动物细胞的研究策略在哺乳动物细胞中开103siRNA设计的原则

siRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100～200bp至翻译终止密码上游50～100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3端相邻19个核苷酸作为候选siRNA靶位点。siRNA设计的原则

siRNA双链设计时，一般在靶mRNA104建议设计的siRNA不要针对mRNA的5和3端非编码区(untranslatedregions，UTRs)，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP(siRNAproteincomplex，核酸内切酶复合物)结合mRNA，从而影响siRNA干扰的效果。最后还应将候选siRNA序列在GenBank进行BLAST检索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。建议设计的siRNA不要针对mRNA的5和3端105siRNA制备方法化学合成体外转录法合成siRNAsiRNA表达载体siRNA表达框架siRNA制备方法化学合成106化学合成早期RNAi实验中，dsRNA或siRNA均由化学法所合成。化学合成的siRNA纯度高，合成量不受限制，且还可对siRNA进行标记，方便对其跟踪但该方法价格昂贵，不适用于siRNA序列的筛选和长期基因沉默实验。化学合成早期RNAi实验中，dsRNA或siRNA107

体外转录法合成siRNA较为经济。根据siRNA序列合成相应DNAOIigo模板，再利用T7RNA聚合酶进行体外转录，分别获得siRNA的正义链和反义链，然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的siRNA。体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制，不过其价格较低，毒性小，稳定性好，效率高。体外转录法合成siRNA

体外转录法合成siRNA较为经济。体外转录法合成108ConstructionofsiRNAbyT7RNApolymerase-mediatedinvitrotranscription.ConstructionofsiRNAbyT7RN109siRNA表达载体为体外合成siRNA，不宜进行长期基因沉默研究。借助表达质粒或病毒载体在细胞内产生siRNA，使研究者无需直接操作RNA就可达到长期抑制靶基因表达的目的，且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆，这将具有更为广阔的应用前景。siRNA表达载体为体外合成siRNA，不宜进行110RNA干扰的应用前景从理论上讲，既然RNA干扰可以使特定的基因“沉默”，就有可能为癌症和艾滋病等顽疾的防治带来革命性的变化。2003年，哈佛大学利伯曼(JudyLieberman)副教授与中山大学附属第二医院宋尔卫博士等人在《自然医学》杂志发表论文，介绍RNA干扰对小鼠急性肝炎的防护作用，被麻省理工学院教授、诺贝尔奖得主夏普(PhilipSharp)称为“首次在整体动物疾病模型中显示RNA干扰的治疗作用”。RNA干扰的应用前景从理论上讲，既然RNA111在实验中，未接受RNA干扰治疗的实验鼠40％在3天内死亡。40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查实验鼠的肝部，发现完全正常。加州大学洛衫矶分校和加州理工学院的研究人员已经开发出使用RNA阻止艾滋病病毒技术进入人体细胞的技术。在实验中，未接受RNA干扰治疗的实验鼠40％在112科学家们已经应用RNA干扰技术，在多种不同的动物疾病模型中获得了良好疗效。此外，“6种基于该技术的药物已经在美国进入II期临床试验，这个速度相当快”。据徐思群介绍，如今这项技术不但在科学研究领域得到广泛应用，可以说“全世界的生物研究所，凡是与基因有关的都在使用这项技术”，而且在制药业和农业等领域也很受关注，“已经有至少50家生化公司和制药企业购买了我们这项专利，去研制相关的产品”。科学家们已经应用RNA干扰技术，在多种不同的113技术障碍首先，科学家还没有找到一种方便快捷的方法，使RNA干扰能在患者体内的有效部位进行，怎么将RNA干扰药物运送到特定的细胞群体，比如肿瘤细胞，就是一大障碍。比如说，在治疗黄斑变性时，科学家可以直接对患者眼部进行治疗，而对于其他一些疾病就没有这么简单。其次，科学家还无法确定这种疗法是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用。技术障碍首先，科学家还没有找到一种方便快捷的方114影响siRNA抑制效率的因素靶mRNA的二级结构：识别序列在靶mRNA的位置，是否可以接近（contradictory）与反义核酸的识别序列并不相同siRNA的修饰siRNA的GC含量影响siRNA抑制效率的因素靶mRNA的二级结构：与反义核酸115NucleicAcid-BasedImmuneSystem哺乳动物抗病毒反应病毒引发RNAiNucleicAcid-BasedImmuneSyst116在一些病毒中发现有RNAi的抑制物在Beetyellowsvirus中发现有p21-likeproteins在RNAi识别的靶序列里面或附近出现核苷酸替换或缺失病毒逃避RNAiHIV－1可以通过改变其基因组RNA的结构而逃避RNAi有些病毒可能是逃避而非抑制RNAi，如特殊的复制、病毒基因组的高突变率、对RNAi的抗性在一些病毒中发现有RNAi的抑制物在Beetyellows117转录水平基因沉寂(transcriptionalgenesilence,TGS)siRNA参与DNA和组蛋白的甲基化，参与异染色质的形成和转录水平基因表达的抑制，也被认为是一种保护机制能阻止转位元件的移动RNAi功能缺失的线虫表现出很高频率的转位作用转录水平基因沉寂siRNA参与DNA和组蛋白的甲118siRNA的设计有效的比例比较高，平均可达到70-80%尚无有效的原则可循一些应考虑的问题：转录终止序列问题GC含量siRNA的设计有效的比例比较高，平均可达到70-80%尚无119问题siRNA表达载体引起interferonresponsesiRNA序列引起interferonresponseoff-target(脱靶效应)microRNA样作用非特异性IFN反应非完全匹配靶基因问题siRNA表达载体引起interferonresp120分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-课件121siRNA用于临床治疗仍亟待解决的问题siRNA用于临床治疗仍亟待解决的问题122siRNA导入体内的方法静脉快速注射siRNA（已开始对肢端缺血、外周动脉闭锁等疾病进入临床实验）肌肉注射siRNA病毒介导的转染：腺病毒、逆转录病毒MPG,derivedfromthefusionpeptidedomainofHIV-1gp41proteinandtheNLSofSV40largeTantigen.MPGformsstablenon-covalentcomplexeswithnucleicacidsandimprovestheirdelivery.肽介导PAMAMG5dendrimer(P)wasonjugatedtoTatpeptide(T),acellpenetratingeptide,insearchofanefficientcellulardeliveryvehicleforantisenseandsiRNAoligonucleotides.siRNA导入体内的方法静脉快速注射siRNA病毒介导的转染123阳离子型脂质体＋静脉或腹膜内注射局部（大鼠视网膜、皮肤）电转化微注射借助抗体导向的脂质体，可穿透血脑屏障siRNA＋不完全胶原质，注射肿瘤阳离子型脂质体＋静脉或腹膜内注射局部（大鼠视网膜、皮肤）电转124提高siRNA稳定性尽量建少非特异性作用及脱靶效应提高siRNA稳定性尽量建少非特异性作用及脱靶效应125问题与展望

RNAi是近年来才发现的一种古老的、保守的生物途径，是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制，具有重大的生物学意义。RNAi现已成为国内外研究的热点，被《Science》评为2002年最重大科技突破。随着对RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完善，RNAi有望成为治疗病毒感染性疾病的新方法。问题与展望

RNAi是近年来才发现的一种古老126存在的问题目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍；

如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；

目前RNAi机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。存在的问题目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有127

美国哈佛医学院的PritiKumar和同事近日开发出了一种利用抗体将短链RNA（siRNAs）直接送至免疫细胞的方法，并通过RNA干扰极大地帮助抑制HIV病毒对小鼠的感染。相关论文8月7日(2008)在线发表于《细胞》（Cell）杂志上。

美国哈佛医学院的PritiKumar和同事近128

研究中利用抗体绑定T细胞表面的CD7蛋白，而T细胞正是HIV感染的主要细胞类型之一。研究人员将siRNAs附着在抗体上，之后被“专一”地送至T细胞。研究人员使用了三种不同的siRNAs。其中一种阻碍HIV借以进入T细胞的表面受体蛋白产生；另外两种标靶HIV基因，如果HIV设法进入了T细胞，它们会阻止它的复制。研究中利用抗体绑定T细胞表面的CD7蛋白，而T细129

Kumar说：“预防和治疗方案都证明是成功的。很明显，siRNAs阻碍HIV进入大部分T细胞，而一旦HIV设法溜进去了，它们也会阻止它的复制。”这种多重攻击也能够降低HIV对治疗产生抗性的风险。美国希望之城贝克曼研究所的JohnRossi说：“这种策略可能被开发成对人类的临床应用。”美国科罗拉多州立大学的RameshAkkina认为：“这种方法可能有助降低对标准高效抗逆转录病毒疗法（HAART）无反应的病人病毒量。”不过他表示，如果抗体-siRNA联合体引发了免疫系统的意外反应，这一疗法就可能变得无效。Kumar说：“预防和治疗方案都证明是成功的。130如何看待RNA??

美国《科学》杂志连续三年（2001-2003）将有关RNA的研究成果列为年度十大科学成就之一。2002年《自然》发表有关对RNA化学和生物学上的许多方面研究进展做了评述。

RNA研究始于19世纪末，是在DNA研究基础上发展起来的。

如何看待RNA??美国《科学》杂志连续三年（20131大致分为三个阶段：