免疫组化4双重或多重标记课件

操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同

优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观

缺点：流程长

脱片机率更高

前后重染色试剂间有交叉干扰操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同

优点：不同抗原1免疫组化4双重或多重标记课件2免疫组化4双重或多重标记课件3二、技术类型（一）双重或多重免疫荧光标记染色采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。二、技术类型4优点：方法敏感、特异缺点：需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影样本不能长期保存组织结构背景不清晰。优点：方法敏感、特异5直接法---特异、快速

间接法---敏感、多用

技术类型抗体试剂异种动物抗体---常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低同种动物抗体---分别应用，操作步骤加倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理直接法---特异、快速间接法---敏感、多用技术类型抗体6

操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）(1)石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化，入PBS。(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育(4)0.05mol/LTBS洗操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重7(5)羊抗鼠IgG-TRITC，避光反应1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。(7)切片脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在80℃烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。(5)羊抗鼠IgG-TRITC，避光反应1h。8(8)切片以TBS洗(9)1％HSA孵育30min(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(12)羊抗鼠IgG-FITC，避光反应1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第二重GH-FITC标记染色完成)。(14)缓冲甘油封片。(8)切片以TBS洗(11)0.05mol/LTBS(pH9(15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）。(16)用彩色底片对切片同一部位用546nm及490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的ACTH与GH两种抗原。(15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光10TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游离FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被灭活图1同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理TRITC-GAM鼠抗人ACTHFITC-GAM鼠抗人GHT11（二）双重或多重免疫酶标记染色

以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。优点：光镜下可以同时观察和对比一次曝光即可成像样品保存时间相对较长（二）双重或多重免疫酶标记染色12

★常用标记酶与底物的配伍

单酶双底物

DAB(棕色):4CN(蓝色)AEC(红色):4CN(蓝色)

坚固红(fastred红色)

坚固蓝(fastblue蓝色)HRPAP-萘酚AS-MX★常用标记酶与底物的配伍HRPAP-萘酚AS-MX13双酶双底物

HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-坚固蓝)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-坚固红)直接法、间接法、桥法均可使用灵敏度以桥法中的复合物法最高特异性则以直接法最佳双酶双底物14操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。间接法与复合物法较常采用。★操作举例淋巴瘤轻链κ、λ的双重酶标记（双酶双底物）操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合15(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后，以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用016(3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，10min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb与抗人λMcAb的混合液)1:200，湿盒，37℃，45min或更长；(5)PBS液，5min×3(3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，10min，不洗；17(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，温盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗体复合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，湿盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，温盒，318(10)过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色7～10min(镜下控制显色程度)，PBS洗，5min×3；(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝(fastblue)显色10～15min(镜下控制显色程度)，PBS洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光镜下观察(10)过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色719PPPAAA

κλ图2双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人PPPAAAκ20注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染色之间是否设置“多聚甲醛蒸气处理2-4h（封闭固定）或用pH2.2的甘氨酸---盐酸溶液处理2h（酸洗脱）的操作步骤”，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。

注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染21（三）双重及多重免疫金标记(电镜）电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标记方法。（三）双重及多重免疫金标记(电镜）22常用的方法多为双重免疫金标记

优点：高电子密度，分辨率高，抗原定位精确，颗粒大小可人工控制，标记试剂易制备。

缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰大(背景)常用的方法多为双重免疫金标记23金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。优点：敏感性提高，操作步骤减少缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深。可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合部位（Fab段）灭活加以克服。金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用24（四）其它双重标记法

1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先酶标

后荧光)；

2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用(先免疫金银标记后荧光标记)；

3.免疫酶法与免疫金法联合应用(20nm,红

色），此法忌用银液放大，易吸附干扰；

4.免疫金银法与免疫酶法联合应用(对比明

显)。

（四）其它双重标记法

1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先25三、注意事项

1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原的性质，量少、脆弱先标记，量多、耐受后标记。

2.结构保存与抗原保护并重，电镜样品一般忌用饿酸后固定，PG固定液中的戊二醛(G)浓度不宜超过2％，光镜样品的固定剂类型和固定时间的选择也应如此；

三、注意事项

1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原的性质263.严格操作步骤，轻柔，洗涤应彻底，洗涤用的TBS中常加入1％Triton×100或Saponin；

4.保证试剂的清洁度与纯度(双蒸水，亲和免疫层析)，注意增强组织片与载玻片的粘合度，以减少脱片机率；

5.封片剂选择应注意显色剂的溶解特性，一般多采用水封片(10%缓冲甘油)，保存时间不长，应及时观察记录。3.严格操作步骤，轻柔，洗涤应彻底，洗涤用的TBS中常加入127操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同

优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观

缺点：流程长

脱片机率更高

前后重染色试剂间有交叉干扰操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同

优点：不同抗原28免疫组化4双重或多重标记课件29免疫组化4双重或多重标记课件30二、技术类型（一）双重或多重免疫荧光标记染色采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。二、技术类型31优点：方法敏感、特异缺点：需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影样本不能长期保存组织结构背景不清晰。优点：方法敏感、特异32直接法---特异、快速

间接法---敏感、多用

技术类型抗体试剂异种动物抗体---常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低同种动物抗体---分别应用，操作步骤加倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理直接法---特异、快速间接法---敏感、多用技术类型抗体33

操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）(1)石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化，入PBS。(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育(4)0.05mol/LTBS洗操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重34(5)羊抗鼠IgG-TRITC，避光反应1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。(7)切片脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在80℃烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。(5)羊抗鼠IgG-TRITC，避光反应1h。35(8)切片以TBS洗(9)1％HSA孵育30min(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(12)羊抗鼠IgG-FITC，避光反应1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第二重GH-FITC标记染色完成)。(14)缓冲甘油封片。(8)切片以TBS洗(11)0.05mol/LTBS(pH36(15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）。(16)用彩色底片对切片同一部位用546nm及490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的ACTH与GH两种抗原。(15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光37TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游离FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被灭活图1同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理TRITC-GAM鼠抗人ACTHFITC-GAM鼠抗人GHT38（二）双重或多重免疫酶标记染色

以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。优点：光镜下可以同时观察和对比一次曝光即可成像样品保存时间相对较长（二）双重或多重免疫酶标记染色39

★常用标记酶与底物的配伍

单酶双底物

DAB(棕色):4CN(蓝色)AEC(红色):4CN(蓝色)

坚固红(fastred红色)

坚固蓝(fastblue蓝色)HRPAP-萘酚AS-MX★常用标记酶与底物的配伍HRPAP-萘酚AS-MX40双酶双底物

HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-坚固蓝)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-坚固红)直接法、间接法、桥法均可使用灵敏度以桥法中的复合物法最高特异性则以直接法最佳双酶双底物41操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。间接法与复合物法较常采用。★操作举例淋巴瘤轻链κ、λ的双重酶标记（双酶双底物）操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合42(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后，以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用043(3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，10min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb与抗人λMcAb的混合液)1:200，湿盒，37℃，45min或更长；(5)PBS液，5min×3(3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，10min，不洗；44(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，温盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗体复合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，湿盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，温盒，345(10)过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色7～10min(镜下控制显色程度)，PBS洗，5min×3；(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝(fastblue)显色10～15min(镜下控制显色程度)，PBS洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光镜下观察(10)过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色746PPPAAA

κλ图2双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人PPPAAAκ47注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染色之间是否设置“多聚甲醛蒸气处理2-4h（封闭固定）或用pH2.2的甘氨酸---盐酸溶液处理2h（酸洗脱）的操作步骤”，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。

注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染48（三）双重及多重免疫金标记(电镜）电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标记方法。（三）双重及多重免疫金标记(电镜）49常用的方法多为双重免疫金标记

优点：高电子密度，分辨率高，抗原定位精确，