基因表达系统大肠杆菌表达系统课件

酵母表达系统优点1属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化2操作容易3经济4快速1酵母表达系统优点1酵母细胞结构2酵母细胞结构2两种酵母表达系统酿酒酵母表达系统Saccharomycescerevisiae过去常用毕赤酵母

Pichiapastoris现在多用3两种酵母表达系统酿酒酵母表达系统毕赤酵母3Pichiapastoris表达系统

Pichiapastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一的碳源.易操作,培养容易表达量高,可达培养液中10g/L可以有真核生物的翻译后修饰,如糖基化避免了酿酒酵母的过糖基化问题4Pichiapastoris表达系统Pichiapa551.Pichiapastoris的表达载体胞内表达载体胞外表达载体P.pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体

61.Pichiapastoris的表达载体胞内表达载体Alcoholoxidase,醇氧化酶,将甲醇氧化成甲醛通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子AOX1是主要的酶受甲醇严格控制启动子用来驱动外源基因表达AOX2利用甲醇的能力低生长慢7Alcoholoxidase,醇氧化酶,将甲醇氧化成甲宿主His4突变，不能合成组氨酸，在His缺陷培养基上不能生长；质粒上有His4,可合成组氨酸，用His缺陷平板筛选转化菌株。histidinoldehydrogenasegene(his4)8宿主His4突变，不能合成组氨酸，在His缺陷培养基上不能2.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR92.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR胞内表达载体,pAO815

10胞内表达载体,pAO81510胞外表达载体,pIC9K11胞外表达载体,pIC9K11pPIC9k,胞外表达载体12pPIC9k,胞外表达载体123.多拷贝产生，pIC9K,体内形成多拷贝因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低未线性化的环状质粒发生同源重组的几率非常低133.多拷贝产生，pIC9K,体内形成多拷贝因为未线性化的pAO815

可体外构建多拷贝14pAO815

可体外构建BamHI：GGATCCCCTAGGBglII：AGATCTTCTAGA15BamHI：GGATCCBglII：AGATCT154.

宿主细胞PichiaStrain基因型GS115AOX1正常，Mul+KM71AOX1被破坏，MulS宿主的histidinoldehydrogenasegene(his4)突变可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长本身的回复突变为1/108。164.宿主细胞PichiaStrain基因型GS115转化后细胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，Mul+AOX1被破坏，MulS转化后对甲醇的利用KM71无论在那里交换，只能是甲醇低利用，因为宿主没有AOX1甲醇高利用SalI、StuI切甲醇低利用BglII切GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上交换的位置是否破坏宿主的AOX117转化后细胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，线性化位点质粒线性化后转化宿主细胞线性化质粒发生同源重组的几率提高18线性化位点质粒线性化后转化宿主细胞线性化质粒发生同源重组的pAO815和pPIC9K在SalI、StuI单切,

在his4插入（单交换），不破坏宿主的AOX1，转化GS115后产生：His+/Mut+单交换同源重组基因转移法：是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。19pAO815和pPIC9K单交换同源重组基因转移法：是将外pAO815和pPIC9K在BglII双切：在5AOX1位点和3AOX1双交换，替换掉了宿主的AOX1基因，转化后GS115产生His+/Muts

BglIIHis45AOX13AOX1geneHis4AOX120pAO815和pPIC9K在BglII双切：BglII2121技术路线选择合适的内切酶位点将基因插入载体注:pAO815和pIC9K是穿梭载体,可在大肠杆菌中操作pAO815体外构建多拷贝转化宿主细胞线性化质粒组氨酸缺陷平板筛选重组子22技术路线选择合适的内切酶位点注:pAO815pAO815转化G418筛选pIC9K多拷贝

PCR检测转化细胞中的基因插入诱导表达SDS检测pAO815和pPIC9K23G418PCR检测诱导表达pAO815和pPIC9K23酵母菌转化PEG1000TransformationMethodforPichiaBufferA:1.0MSorbitol(山梨醇),10mMBicine（N-二羟乙基甘氨酸）,pH8.35(Sigma),3%(v/v)ethyleneglycol(乙二醇

)BufferB:40%(w/v)Polyethyleneglycol1000(Sigma),0.2MBicine,pH8.35BufferC:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35Filtersterilizeandstoreat-20°C.24酵母菌转化PEG1000TransformationM制备感受态细胞1.划线接种酵母菌，YPD平板，30°Cfortwodays.2.挑菌落于10mlYPD30°C摇过夜.3.转培养到100mlYPD，startingOD600of0.1andgrowat30°CtoanOD600of0.5to0.8.4.3000xg收集细胞，用50mlofBufferA洗细胞，室温.5.细胞悬浮在4mlofBufferA中，分装成0.2ml于灭菌的管中，每管加11μlDMSO（-70度），混匀，液氮快速冷冻，-70°C保存。25制备感受态细胞1.划线接种酵母菌，YPD平板，30°C保持感受态细胞在冰冻状态作转化！Cellcompetencedecreasesveryrapidlyafterthecellsthawevenwhenheldonice.

ItiscriticaltoaddDNAtofrozencellsamples.

Toperformmultipletransformations,itisrecommendedtoprocessthemingroupsofsixatatime.26保持感受态细胞在冰冻状态作转化！CellcompetencTransformation1.10-50μgDNA（20μl液体中），直接加到still-frozentubeofcompetentcells（40μgofdenaturedandsonicatedsalmonspermDNA）；2.37°C水浴5分钟，中间混匀两次；3.加1.5mlofBufferB，彻底混匀；4.30°C水浴1hour；5.2000xg离心10，RT，去上清，细胞悬浮在1.5mlBufferC中；6.离心后将细胞悬浮在0.2mlBufferC中；7.将细胞涂布在选择培养平板（MD）上，30°Cfor3to4days.27Transformation1.10-50μgDNA储存液10XYNB(13.4%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithoutaminoacids)，抽滤；500XB(0.02%Biotin)，抽滤；10XD(20%Dextrose葡萄糖)，抽滤；10XM(5%Methanol)，抽滤；10XGY(10%Glycerol)，高压；1Mpotassiumphosphatebuffer,pH6.0，高压。28储存液10XYNB(13.4%YeastNitrogYPD培养基YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1liter)1%yeastextract2%peptone900mlofwaterAutoclavefor20minutesonliquidcycle.2%dextrose(glucose)，（20%储存液，抽滤灭菌）。Note:Add20gofagarifmakingYPDplates。29YPD培养基YeastExtractPeptoneDeMinimalDextrose

MD平板成分：1.34%YNB（yeastnitrogenbase，酵母培养基）4x10-5%biotin2%dextrose配制方法：1.800ml水，（平板加15gagar），灭菌20；2.冷却到60°C，加100mlof10XYNB，2mlof500Xbiotin，100mlof10Xdextrose；3.倒平板。30MinimalDextrose

MD平板成分：1.34%

BMGY：BufferedGlycerol-complexMedium

BMMY：BufferedMethanol-complexMedium(1liter)

成分：1%yeastextract2%peptone100mMpotassiumphosphate,pH6.01.34%YNB4x10-5%biotin

1%glycerol（BMGY）or0.5%methanol（BMMY）31

BMGY：BufferedGlycerol-comp323233333434毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。2.操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

35毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：35毕赤酵母系统的注意事项严格无菌操作，防止污染；可以镜检温度≤30C;转化PCR检测5.诱导时间36毕赤酵母系统的注意事项严格无菌操作，防止污染；可以镜检36酵母蛋白糖基化酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型；然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露糖残基）短得多，但比人的大；酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。37酵母蛋白糖基化酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露蛋白质糖基化蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式；糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。38蛋白质糖基化蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方1、N-linkedglycosylationasugarattachtotheaminogroupofanasparagine（天冬氨酰）.

sequencemotifAsn-Xaa-Ser/Thr39392、O-linkedglycosylation,InO-glycosylation,asugarisattachedtothehydroxylgroupofaserineorthreonineresidue.

nosequencemotifdefined402、O-linkedglycosylation,InO3、C-Mannosylation（甘露糖化）sugarislinkedtotheproteinthroughacarbon-carbonbond.413、C-Mannosylation（甘露糖化）414、GPIanchorattachments.Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchoredproteins.糖基磷脂酰肌醇锚bindingtotheplasmamembrane424、GPIanchorattachments.Gly酵母表达系统优点1属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化2操作容易3经济4快速43酵母表达系统优点1酵母细胞结构44酵母细胞结构2两种酵母表达系统酿酒酵母表达系统Saccharomycescerevisiae过去常用毕赤酵母

Pichiapastoris现在多用45两种酵母表达系统酿酒酵母表达系统毕赤酵母3Pichiapastoris表达系统

Pichiapastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一的碳源.易操作,培养容易表达量高,可达培养液中10g/L可以有真核生物的翻译后修饰,如糖基化避免了酿酒酵母的过糖基化问题46Pichiapastoris表达系统Pichiapa4751.Pichiapastoris的表达载体胞内表达载体胞外表达载体P.pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体

481.Pichiapastoris的表达载体胞内表达载体Alcoholoxidase,醇氧化酶,将甲醇氧化成甲醛通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子AOX1是主要的酶受甲醇严格控制启动子用来驱动外源基因表达AOX2利用甲醇的能力低生长慢49Alcoholoxidase,醇氧化酶,将甲醇氧化成甲宿主His4突变，不能合成组氨酸，在His缺陷培养基上不能生长；质粒上有His4,可合成组氨酸，用His缺陷平板筛选转化菌株。histidinoldehydrogenasegene(his4)50宿主His4突变，不能合成组氨酸，在His缺陷培养基上不能2.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR512.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR胞内表达载体,pAO815

52胞内表达载体,pAO81510胞外表达载体,pIC9K53胞外表达载体,pIC9K11pPIC9k,胞外表达载体54pPIC9k,胞外表达载体123.多拷贝产生，pIC9K,体内形成多拷贝因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低未线性化的环状质粒发生同源重组的几率非常低553.多拷贝产生，pIC9K,体内形成多拷贝因为未线性化的pAO815

可体外构建多拷贝56pAO815

可体外构建BamHI：GGATCCCCTAGGBglII：AGATCTTCTAGA57BamHI：GGATCCBglII：AGATCT154.

宿主细胞PichiaStrain基因型GS115AOX1正常，Mul+KM71AOX1被破坏，MulS宿主的histidinoldehydrogenasegene(his4)突变可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长本身的回复突变为1/108。584.宿主细胞PichiaStrain基因型GS115转化后细胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，Mul+AOX1被破坏，MulS转化后对甲醇的利用KM71无论在那里交换，只能是甲醇低利用，因为宿主没有AOX1甲醇高利用SalI、StuI切甲醇低利用BglII切GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上交换的位置是否破坏宿主的AOX159转化后细胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，线性化位点质粒线性化后转化宿主细胞线性化质粒发生同源重组的几率提高60线性化位点质粒线性化后转化宿主细胞线性化质粒发生同源重组的pAO815和pPIC9K在SalI、StuI单切,

在his4插入（单交换），不破坏宿主的AOX1，转化GS115后产生：His+/Mut+单交换同源重组基因转移法：是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。61pAO815和pPIC9K单交换同源重组基因转移法：是将外pAO815和pPIC9K在BglII双切：在5AOX1位点和3AOX1双交换，替换掉了宿主的AOX1基因，转化后GS115产生His+/Muts

BglIIHis45AOX13AOX1geneHis4AOX162pAO815和pPIC9K在BglII双切：BglII6321技术路线选择合适的内切酶位点将基因插入载体注:pAO815和pIC9K是穿梭载体,可在大肠杆菌中操作pAO815体外构建多拷贝转化宿主细胞线性化质粒组氨酸缺陷平板筛选重组子64技术路线选择合适的内切酶位点注:pAO815pAO815转化G418筛选pIC9K多拷贝

PCR检测转化细胞中的基因插入诱导表达SDS检测pAO815和pPIC9K65G418PCR检测诱导表达pAO815和pPIC9K23酵母菌转化PEG1000TransformationMethodforPichiaBufferA:1.0MSorbitol(山梨醇),10mMBicine（N-二羟乙基甘氨酸）,pH8.35(Sigma),3%(v/v)ethyleneglycol(乙二醇

)BufferB:40%(w/v)Polyethyleneglycol1000(Sigma),0.2MBicine,pH8.35BufferC:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35Filtersterilizeandstoreat-20°C.66酵母菌转化PEG1000TransformationM制备感受态细胞1.划线接种酵母菌，YPD平板，30°Cfortwodays.2.挑菌落于10mlYPD30°C摇过夜.3.转培养到100mlYPD，startingOD600of0.1andgrowat30°CtoanOD600of0.5to0.8.4.3000xg收集细胞，用50mlofBufferA洗细胞，室温.5.细胞悬浮在4mlofBufferA中，分装成0.2ml于灭菌的管中，每管加11μlDMSO（-70度），混匀，液氮快速冷冻，-70°C保存。67制备感受态细胞1.划线接种酵母菌，YPD平板，30°C保持感受态细胞在冰冻状态作转化！Cellcompetencedecreasesveryrapidlyafterthecellsthawevenwhenheldonice.

ItiscriticaltoaddDNAtofrozencellsamples.

Toperformmultipletransformations,itisrecommendedtoprocessthemingroupsofsixatatime.68保持感受态细胞在冰冻状态作转化！CellcompetencTransformation1.10-50μgDNA（20μl液体中），直接加到still-frozentubeofcompetentcells（40μgofdenaturedandsonicatedsalmonspermDNA）；2.37°C水浴5分钟，中间混匀两次；3.加1.5mlofBufferB，彻底混匀；4.30°C水浴1hour；5.2000xg离心10，RT，去上清，细胞悬浮在1.5mlBufferC中；6.离心后将细胞悬浮在0.2mlBufferC中；7.将细胞涂布在选择培养平板（MD）上，30°Cfor3to4days.69Transformation1.10-50μgDNA储存液10XYNB(13.4%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithoutaminoacids)，抽滤；500XB(0.02%Biotin)，抽滤；10XD(20%Dextrose葡萄糖)，抽滤；10XM(5%Methanol)，抽滤；10XGY(10%Glycerol)，高压；1Mpotassiumphosphatebuffer,pH6.0，高压。70储存液10XYNB(13.4%YeastNitrogYPD培养基YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1liter)1%yeastextract2%peptone900mlofwaterAutoclavefor20minutesonliquidcycle.2%dextrose(glucose)，（20%储存液，抽滤灭菌）。Note:Add20gofagarifmakingYPDplates。71YPD培养基YeastExtractPeptoneDeMinimalDextrose

MD平板成分：1.34%YNB（yeastnitrogenbase，酵母培养基）4x10-5%biotin2%dextrose配制方法：1.800ml水，（平板加15gagar），灭菌20；2.冷却到60°C，加100mlof10XYNB，2mlof500Xbiotin，100mlof10Xdextrose；3.倒平板。72MinimalDextrose

MD平板成分：1.34%

BMGY：BufferedGlycerol-complexMedium

BMMY：BufferedMethanol-complexMedium(1liter)

成分：1%yeastextract2%peptone100mMpotassiumphosphate,pH6.01.34%YNB4x10-5%biotin

1%glycerol（BMGY）or0.5%methanol（BMMY）73

BMGY：BufferedGlycerol-comp743275337634毕赤酵