第六章-微生物的生长与控制课件

蚌埠学院食品与生物工程系1第六章微生物的生长繁殖及其控制蚌埠学院食品与生物工程系1第六章微生物的生长繁殖及其控蚌埠学院食品与生物工程系2目的要求通过本章的课堂教学，了解微生物生长繁殖的规律，掌握微生物生长的测定方法，及各种物理、化学因素对微生物生长的影响。

蚌埠学院食品与生物工程系2目的要求通过本章的课堂教学，了蚌埠学院食品与生物工程系3教学内容(4学时)生物生长的测定以数量变化对微生物生长情况进行测定以生物量为指标测定微生物的生长细菌的群体生长繁殖生长曲线同步培养连续培养微生物生长繁殖的控制控制微生物的化学物质控制微生物的物理因素蚌埠学院食品与生物工程系3教学内容(4学时)生物生长的测蚌埠学院食品与生物工程系4第一节微生物生长的测定蚌埠学院食品与生物工程系4第一节微生物生长的测定微生物生长表现为微生物数量或质量的变化，通过此类指标测定可以了解微生物的生长状况，如：评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律等蚌埠学院食品与生物工程系5微生物生长表现为微生物数量或质量的变化，通过此类指标测定可以一、计数法可用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的孢子计数。蚌埠学院食品与生物工程系6一、计数法可用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的1.显微镜直接计数法利用血球计数板或细菌计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积的样品中微生物的数量）。蚌埠学院食品与生物工程系7细菌计数板常用于原核生物血球计数板可用于原核生物和真核生物1.显微镜直接计数法利用血球计数板或细菌计数板，在显微镜下对血球计数板计数室（容积）体积=1x0.1mm3=10-4mL计数室小格数=400个=25x16or16x25每毫升原液中细菌数(cell/mL)=[(每小格平均细菌数x400)/0.1mm3]x稀释倍数=每小格平均细菌数x400x10000x稀释倍数=每小格平均细菌数x稀释倍数x4x106蚌埠学院食品与生物工程系8血球计数板蚌埠学院食品与生物工程系8蚌埠学院食品与生物工程系9蚌埠学院食品与生物工程系9细菌计数板计数室（容积）体积=1x0.02mm3=2x10-5mL(cm3)计数室中方格数=25个每毫升原液中细菌数(cell/mL)=[(每中方格平均细菌数x25)/0.02mm3]x稀释倍数=每中方格平均细菌数x25x5x104x稀释倍数=每中方格平均细菌数x稀释倍数x1.25x106蚌埠学院食品与生物工程系10细菌计数板蚌埠学院食品与生物工程系10优点：快速简便，还可以知道细胞的大小和形态特征。缺点：需要相对高的细菌浓度（不适合低浓度菌体溶液）；不进行特殊染色时，不能区分死菌与活菌,所计为总菌数；不适于对运动细菌的计数；

个体小的细菌在显微镜下难以观察。（用细菌计数板比血球计数板更合适）蚌埠学院食品与生物工程系11优点：快速简便，还可以知道细胞的大小和形态特征。蚌埠学院采用特定的染色技术也可对活菌和死菌分别进行计数，如利用美兰染液可进行酵母的活菌计数。蚌埠学院食品与生物工程系12采用特定的染色技术也可对活菌和死菌分别进行计数，如利用美兰染对运动细菌的计数：通过加入甲醛等物质先破坏其运动性，然后进行计数。蚌埠学院食品与生物工程系13个体小的细菌在显微镜下难以观察用细菌计数板比血球计数板更合适;结合染色、相差显微镜及荧光显微镜计数。对运动细菌的计数：通过加入甲醛等物质先破坏其运动性，然后进行当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数。蚌埠学院食品与生物工程系14当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品2、间接计数法—活菌计数法通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、酵母菌、孢子）蚌埠学院食品与生物工程系152、间接计数法—活菌计数法通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微（1）平板菌落计数法—活菌计数法原理：每一个单个的微生物细胞在合适的培养基和生长条件下，可以在平板上通过生长形成菌落。通过菌落数量的计数，计算样品中的活菌数。其方法流程如下：蚌埠学院食品与生物工程系16（1）平板菌落计数法—活菌计数法原理：每一个单个的微生物细胞蚌埠学院食品与生物工程系17蚌埠学院食品与生物工程系17蚌埠学院食品与生物工程系18蚌埠学院食品与生物工程系18蚌埠学院食品与生物工程系19蚌埠学院食品与生物工程系19（2）膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计（CFU/ml)。蚌埠学院食品与生物工程系20（2）膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、二、生物量（质量）的测定1、重量法蚌埠学院食品与生物工程系21(1)直接以菌体的干重/湿重衡量微生物群体的生物量；(2)通过样品中含量稳定的细胞组分，如蛋白质、核酸含量的测定，间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状的放线菌和真菌生长情况的有效方法二、生物量（质量）的测定1、重量法蚌埠学院食品与生物工程蚌埠学院食品与生物工程系22蚌埠学院食品与生物工程系222、比浊法该方法快速、灵敏应当注意的是：细胞应当呈分散的均匀状生长，实验测量应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。蚌埠学院食品与生物工程系232、比浊法该方法快速、灵敏蚌埠学院食品与生物工程系23蚌埠学院食品与生物工程系24蚌埠学院食品与生物工程系243、生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的生长成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。蚌埠学院食品与生物工程系253、生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、蚌埠学院食品与生物工程系26第二节细菌的群体生长繁殖

微生物的个体生长与同步生长单细胞微生物的生长曲线微生物的连续培养微生物的高密度培养蚌埠学院食品与生物工程系26第二节细菌的群体生长繁殖蚌埠学院食品与生物工程系27蚌埠学院食品与生物工程系27基本概念：分批培养是微生物培养的一种方式。指的是在三角瓶或者发酵罐等培养容器中，放入一定量的培养基，接种微生物细胞，置于合适的条件下进行培养。整个培养过程中，既没有新鲜培养基的加入，也没有内部培养物的移出，最后一次性收获细胞或者代谢产物的培养过程。蚌埠学院食品与生物工程系28基本概念：分批培养蚌埠学院食品与生物工程系28基本概念：分批培养在分批培养的条件下，微生物在封闭的系统中进行生长，导致营养物质消耗，浓度降低；代谢产物的产生以及代谢废物的积累。——内部是一个不断变化的环境，又是如何影响其中的微生物的生长？蚌埠学院食品与生物工程系29对分批培养条件下的微生物生长进行测定：——定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以细胞数量的对数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间生长规律的曲线。基本概念：分批培养蚌埠学院食品与生物工程系29对分批培养蚌埠学院食品与生物工程系30蚌埠学院食品与生物工程系30一、生长曲线蚌埠学院食品与生物工程系31一、生长曲线蚌埠学院食品与生物工程系31蚌埠学院食品与生物工程系32典型生长曲线培养时间(h)I延滞期II指数期III稳定期IV衰亡期0生长速度总菌数活菌数IIIIIIIVlg细胞数(个/ml)蚌埠学院食品与生物工程系32典型生长曲线培养时间(h)I蚌埠学院食品与生物工程系331、延滞期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。蚌埠学院食品与生物工程系331、延滞期将少量菌种接入新鲜细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。蚌埠学院食品与生物工程系34细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。蚌埠学院食品与生物工程系35代谢调整迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；利用对数生长期的细胞作为种子；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量。蚌埠学院食品与生物工程系36在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：通过遗传学方法改变种的遗传2、对数生长期又称：指数生长期，其特点：细胞以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈指数方式增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。蚌埠学院食品与生物工程系372、对数生长期又称：指数生长期，其特点：蚌埠学院食品与生3、稳定生长期由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。蚌埠学院食品与生物工程系383、稳定生长期由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化稳定生长期：是细胞重要的分化调节阶段，如芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，如某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。是以细胞生产为目的的最适收获阶段。蚌埠学院食品与生物工程系39稳定生长期：蚌埠学院食品与生物工程系394、衰亡期营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。蚌埠学院食品与生物工程系404、衰亡期营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。蚌埠学院食品与生物工程系41由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准二、指数生长期中几个重要的生长参数指数生长期其特点：细胞生长速率最大，细菌数量呈指数增加；细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长；对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致；代谢旺盛、生长迅速、代时稳定。所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。蚌埠学院食品与生物工程系42二、指数生长期中几个重要的生长参数指数生长期其特点：蚌埠学院1、世代数从t0

到t时间内微生物繁殖了多少代？---n代蚌埠学院食品与生物工程系43Nt=N0·2n两边取对数：logNt=logN0+nlog2n=[logNt-logN0]/log2=[logNt-logN0]/3.3221、世代数从t0到t时间内微生物繁殖了多少代？---n2、代时在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间--------代时通常以G表示。假设，从时间t0

到t，细菌繁殖n代，则：蚌埠学院食品与生物工程系44G=(t-t0)/n

=3.322(t-t0)/

[logNt-logN0]2、代时在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，在3、平均生长速度常数分批培养中，生长速度用平均生长速度常数（R）表示，单位时间内的世代数（单位时间里微生物繁殖的代数）。假设，从时间t0

到t，细菌繁殖n代，则：蚌埠学院食品与生物工程系45R=n/(t-t0)=3.322[logNt-logN0]/(t-t0)

3、平均生长速度常数分批培养中，生长速度用平均生长速度常数（影响微生物增代时间（代时）的因素：菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。蚌埠学院食品与生物工程系46影响微生物增代时间（代时）的因素：蚌埠学院食品与生物工程蚌埠学院食品与生物工程系47一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes 组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉汤 37 48Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200蚌埠学院食品与生物工程系47一些细菌的代时菌名 培养基 蚌埠学院食品与生物工程系48不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：

E.Coli在不同温度下的代时温度（℃） 代时（分） 温度（℃） 代时（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77蚌埠学院食品与生物工程系48不同温度下的代时温度对微生物凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。限制性因子多是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐在低浓度下，既影响生长速度也影响产量。蚌埠学院食品与生物工程系49凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生蚌埠学院食品与生物工程系508.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量蚌埠学院食品与生物工程系508.0mg/ml只最大收生长三、同步培养使群体中的细胞处于比较一致的同样的生长发育阶段上，使大多数细胞达到同时进行生长或分裂的培养方法，称为同步培养。蚌埠学院食品与生物工程系51通过同步培养方法获得的细胞被称为----同步细胞或同步培养物同步细胞处于同一生长阶段，进行培养时能够同时进行生长和分裂，这种生长方式称为同步生长。三、同步培养使群体中的细胞处于比较一致的同样的生长发育阶段上1、同步培养的方法—获得同步生长细胞的方法蚌埠学院食品与生物工程系521、同步培养的方法—获得同步生长细胞的方法蚌埠学院食品与硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步细胞的方法蚌埠学院食品与生物工程系53硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步细胞的方法蚌埠学院食品2、同步生长蚌埠学院食品与生物工程系54同步生长：表现为阶梯式的曲线；随机生长：表现为直线由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。2、同步生长蚌埠学院食品与生物工程系54同步生长：表现为典型生长曲线反映的是分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）时的生长规律。蚌埠学院食品与生物工程系55将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。培养基一次加入，不予补充，不再更换，导致出现稳定期和衰亡期。我们的期望：长期保持对数生长期的平衡生长状态。典型生长曲线反映的是分批培养（batchculture）o四、连续培养在分批培养达到对数期的后期时，采用不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物的措施，达到一种动态平衡，使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去。——连续培养(Continousculture）蚌埠学院食品与生物工程系56四、连续培养在分批培养达到对数期的后期时，采用不断的补充营养蚌埠学院食品与生物工程系57蚌埠学院食品与生物工程系57蚌埠学院食品与生物工程系581、恒浊连续培养一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的所用培养基中不含有限制性必需营养物，可以使菌体维持最高的生长速率，获得最大生长量。蚌埠学院食品与生物工程系581、恒浊连续培养一种根据培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业蚌埠学院食品与生物工程系59（连续发酵）缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；连续发酵与单批发酵相比的优点：缺点：杂菌污染和菌种退化一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业蚌埠学2.恒化连续培养保持培养液流速不变，控制培养基中某种营养物质（生长限制性因子）浓度基本恒定的方式。蚌埠学院食品与生物工程系60恒化连续培养中，通常将微生物的某种必需营养物质控制在较低的浓度，以作为生长限制性因子，而其他营养物均过量，细菌的生长速率取决于生长限制性因子的浓度，并低于最高生长速率。限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。2.恒化连续培养保持培养液流速不变，控制培养基中某种营养物营养物浓度与生长速率、产量的关系蚌埠学院食品与生物工程系61在一定浓度下，通过控制流速可以得到不同生长速率的培养物营养物浓度与生长速率、产量的关系蚌埠学院食品与生物工程系基本参数以及相互关系：f:培养液的流加速度(L/h)V:培养器中培养液的有效体积D:稀释率，D=f/V(h-1)，代表营养物质的更新速度，或者培养基每小时流过培养容器的有效体积.蚌埠学院食品与生物工程系62基本参数以及相互关系：蚌埠学院食品与生物工程系62蚌埠学院食品与生物工程系63在恒化连续培养系统中：微生物的数量和代时都与稀释率（D）有关。蚌埠学院食品与生物工程系63在恒化连续培养系统中：微生物净增细菌数：dN=N-DN=(–D)N与D的关系决定该连续培养的状态与菌数变化规律：>D：菌数净增，消耗营养，积累产物，趋向于分批培养（不可实现，因为比生长速度受到生长限制性因子的控制）；=D：连续培养达到平衡状态，菌数维持在恒定水平；<D：菌数被稀释，直到完全洗出。蚌埠学院食品与生物工程系64培养容器中细菌数的变化包括2方面：增加速率:dN/dt=μN;减少速率：dN/dt=DN净增细菌数：dN=N-DN=(–D)恒化连续培养与恒浊连续培养的比较在恒浊连续培养中，参量稀释速度在不断地变化；而恒化连续培养中，该参数为一恒定值。在恒浊连续培养中，培养基中不存在生长限制因素。恒浊连续培养在高稀释速度下运行最好，恒化连续培养在低稀释速度下最稳定有效。蚌埠学院食品与生物工程系65恒化连续培养与恒浊连续培养的比较在恒浊连续培养中，参量稀释速蚌埠学院食品与生物工程系66第三节微生物生长繁殖的控制蚌埠学院食品与生物工程系66第三节微生物生长繁殖的控制一、影响微生物生长繁殖的环境因素营养物质水活度温度pH氧蚌埠学院食品与生物工程系67温度pH氧一、影响微生物生长繁殖的环境因素营养物质蚌埠学院食品与生1、温度最适生长温度：代时最短或者生长速率最高时的培养温度。蚌埠学院食品与生物工程系68生长温度三基点1、温度最适生长温度：代时最短或者生长速率最高时的培养温度。蚌埠学院食品与生物工程系69蚌埠学院食品与生物工程系69微生物可生长温度范围的广泛性（p148，表6-3）蚌埠学院食品与生物工程系70微生物可生长温度范围的广泛性（p148，表6-3）蚌埠学院2、pH蚌埠学院食品与生物工程系71某一个微生物生长pH的三基点；整个微生物世界可生长pH的广泛性。嗜酸性:0—5.5嗜中性:5.5—8.0嗜酸性:8.0—11.52、pH蚌埠学院食品与生物工程系71某一个微生物生长pHpH对微生物生长的影响不同生长阶段和不同的生理、生化过程具有不同的最适pH；如Aspergillusniger,pH=2.5-6.5,菌体生长为主；pH=2.0-2.5,利于合成柠檬酸；pH=7.0,大量合成草酸。微生物外环境pH变化较大,但胞内pH相对稳定，接近中性，有利于保护生物大分子以及细胞器的功能（如膜对H+的低透性，转运或缓冲作用）。pH会影响细胞膜的透性和稳定性。pH会影响营养物质的离子化程度，影响其吸收和运输。蚌埠学院食品与生物工程系72pH对微生物生长的影响蚌埠学院食品与生物工程系723、氧微生物与氧的关系（p150,表6-6）蚌埠学院食品与生物工程系733、氧微生物与氧的关系（p150,表6-6）蚌埠学院蚌埠学院食品与生物工程系74蚌埠学院食品与生物工程系74蚌埠学院食品与生物工程系75蚌埠学院食品与生物工程系75氧对生物的毒害作用机制O2在生物体内可由酶促或者非酶促反应产生：超氧化物自由基：·O2-过氧化物，如H2O2强氧化性的羟基自由基：OH·其共同的特性是：化学性质不稳定，反应能力极强，与生物大分子作用，形成生物大分子的活性氧化物，破坏其功能。蚌埠学院食品与生物工程系76氧对生物的毒害作用机制蚌埠学院食品与生物工程系76二、控制微生物的化学物质能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质蚌埠学院食品与生物工程系77抗微生物剂人工合成的化合物生物合成的天然产物二、控制微生物的化学物质能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学化学物质的抗微生物能力的测定液体培养法——最低抑制浓度实验(MIC）（minimuminhibitoryconcentration)平板培养法——抑菌圈试验（zoneofinhibition）蚌埠学院食品与生物工程系78化学物质的抗微生物能力的测定蚌埠学院食品与生物工程系78被测化学物质浓度升高蚌埠学院食品与生物工程系79被测化学物质浓度升高蚌埠学院食品与生物工程系79化学物质的抗微生物能力测定实例。无法区分化学物质的抗菌作用方式：杀菌？抑菌作用？蚌埠学院食品与生物工程系80化学物质的抗微生物能力测定实例。蚌埠学院食品与生物工程系蚌埠学院食品与生物工程系81蚌埠学院食品与生物工程系81蚌埠学院食品与生物工程系82蚌埠学院食品与生物工程系82（一）防腐剂和消毒剂消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。蚌埠学院食品与生物工程系83特点：对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内的化学治疗。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。（见P155，表6-8常用的防腐剂和消毒剂）（一）防腐剂和消毒剂消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸

(Lister首创消毒外科--)蚌埠学院食品与生物工程系84石炭酸系数：指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：蚌埠学院食品与生（二）抗代谢物有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物(Antimetabolite)或者称为正常代谢物的拮抗剂。蚌埠学院食品与生物工程系85（二）抗代谢物有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病。蚌埠学院食品与生物工程系86大多数G+细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等）某些G-细菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用。磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多磺胺药物的发现1934年，德国I.G.Farben染料厂的G.Domagk蚌埠学院食品与生物工程系87法国人Trefouel和英国人Fuller一种红色染料百浪多息（prontosil），白鼠静脉注射，可治疗因链球菌引起的感染，但在体外却无作用。1935年，进一步证明百浪多息对人的链球菌病也有效。百浪多息在体内转化成了具有抑菌作用的磺胺类物质磺胺药物的发现1934年，德国I.G.Farben染料作用机理：磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物蚌埠学院食品与生物工程系88作用机理：磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物蚌埠学院作用机理----磺胺药的选择毒性磺胺的抑菌作用是因为很多细菌能够自己合成叶酸而生长蚌埠学院食品与生物工程系89磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。作用机理----磺胺药的选择毒性磺胺的抑菌作用是因为很多细菌（三）抗生素是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。蚌埠学院食品与生物工程系90自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅几十种。（三）抗生素是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生作用机制抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成蚌埠学院食品与生物工程系91抑制微生物的生长繁殖或杀死它们作用机制抑制细菌细胞壁合成、蚌埠学院食品与生物工程系91蚌埠学院食品与生物工程系92蚌埠学院食品与生物工程系92蚌埠学院食品与生物工程系93蚌埠学院食品与生物工程系93蚌埠学院食品与生物工程系94蚌埠学院食品与生物工程系94蚌埠学院食品与生物工程系95蚌埠学院食品与生物工程系95蚌埠学院食品与生物工程系96蚌埠学院食品与生物工程系96蚌埠学院食品与生物工程系97蚌埠学院食品与生物工程系97细菌抗药性的产生抗性菌株特点：蚌埠学院食品与生物工程系98细胞质膜透性改变:使抗生素不进入细胞或进入细胞后被细胞主动排出；药物作用靶点的修饰和改变；合成了修饰抗生素的酶：如转乙酰酶、磷酸化酶等，修饰的抗生素失去活性；抗性菌株发生遗传变异：导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体；细菌抗药性的产生抗性菌株特点：蚌埠学院食品与生物工程系9避免出现细菌的耐药性的措施第一次使用的药物剂量要足；避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；不同的抗生素(或与其他药物)混合使用；对现有抗生素进行改造；筛选新的更有效的抗生素；蚌埠学院食品与生物工程系99避免出现细菌的耐药性的措施蚌埠学院食品与生物工程系99三、控制微生物的物理因素杀灭或抑制微生物的物理因素蚌埠学院食品与生物工程系100温度•辐射作用•过滤•渗透压•干燥•超声波三、控制微生物的物理因素杀灭或抑制微生物的物理因素蚌埠学院（一）温度当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用（见P155）蚌埠学院食品与生物工程系101高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。（一）温度当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度衡量高温杀菌效果的定量指标：热致死时间：在一定温度下，杀死所有某一浓度的微生物所需要的时间。十倍致死时间：在一定温度下，微生物数量减少十倍所需要的时间。热致死温度：一定时间内，杀死水悬液中某微生物所需的最低温度。蚌埠学院食品与生物工程系102衡量高温杀菌效果的定量指标：蚌埠学院食品与生物工程系101、干热灭菌干热灭菌原理：破坏细胞膜、蛋白质变性、原生质干燥、高温下的氧化作用。蚌埠学院食品与生物工程系103干热灭菌烘箱内热空气灭菌火焰灼烧法170℃，1h160℃，2h121℃，16h1、干热灭菌干热灭菌原理：破坏细胞膜、蛋白质变性、原生质干燥2、湿热灭菌湿热比干热灭菌更好更易于传递热量；更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；蚌埠学院食品与生物工程系104湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5-10min；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理；细菌的芽孢：121℃处理15min可被杀死；2、湿热灭菌湿热比干热灭菌更好蚌埠学院食品与生物工程系1巴斯德消毒蚌埠学院食品与生物工程系10560℃处理30min，或者72-85℃15s煮沸消毒间歇灭菌常规高压灭菌连续加压灭菌121℃，15分钟；115℃，30分钟；指示菌：嗜热脂肪芽孢杆菌135-150℃，5-15秒，工业上发酵培养基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液态食品（超高温灭菌）巴斯德消毒蚌埠学院食品与生物工程系10560℃处理30m（二）辐射作用辐射灭菌(RadiationSterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。蚌埠学院食品与生物工程系106用于灭菌的电磁波微波，紫外线(UV)X-射线γ-射线等（二）辐射作用辐射灭菌(RadiationSterili微波：通过产热杀死微生物。蚌埠学院食品与生物工程系107紫外线(UV)：使DNA相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA的复制和转录，杀死微生物。特点：穿透能力弱，用于空气和器皿表面消毒X-射线和γ-射线：（1）可以直接作用与生物大分子，破坏其结构，抑制或者杀死微生物；（2）也可以氧化物质产生自由基，间接昨用于生物大分子微波：通过产热杀死微生物。蚌埠学院食品与生物工程系107（三）过滤作用空气和不耐热的液体培养基的灭菌蚌埠学院食品与生物工程系108（三）过滤作用空气和不耐热的液体培养基的灭菌蚌埠学院食品蚌埠学院食品与生物工程系109蚌埠学院食品与生物工程系109四、微生物的菌种保藏技术菌种保藏的意义：微生物菌种是一种珍贵的自然资源；（如：耐高浓度酒精、抗生素高产、病原菌株等）只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。性状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。蚌埠学院食品与生物工程系110四、微生物的菌种保藏技术菌种保藏的意义：蚌埠学院食品与生蚌埠学院食品与生物工程系111蚌埠学院食品与生物工程系111菌种保藏机构的作用：收集保藏各种纯培养物及其资料（培养基及性状等），提供菌种的查询和索取等业务，便于交流、研究和使用。蚌埠学院食品与生物工程系112菌种保藏机构的作用：蚌埠学院食品与生物工程系112性状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，影响微生物菌种性状稳定性的因素：死亡污染变异蚌埠学院食品与生物工程系113菌种保藏基本要求：在一定时间内使菌种不死、不乱、不变性状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，影响菌种保藏：根据菌种特性和保藏目的的不同，提供微生物以特定的条件，使菌株的代谢水平降低，或者处于休眠或者半休眠的停止状态，保证其存活和延续，在需要的时候通过提供适宜的生长条件使其恢复活力，以便于研究和使用。蚌埠学院食品与生物工程系114菌种保藏：根据菌种特性和保藏目的的不同，提供微生物以特定的条使菌株的代谢水平降低，或者处于休眠或者半休眠的状态，保证其存活和延续的条件：（1）低温（2）干燥（3）缺氧（4）避光（5）缺乏营养蚌埠学院食品与生物工程系115使菌株的代谢水平降低，或者处于休眠或者半休眠的状态，保证其存菌株保藏基本方法及特点蚌埠学院食品与生物工程系116菌株保藏基本方法及特点蚌埠学院食品与生物工程系116优点：方便使用，是一种基本的保存方法。不足之处：时间短:数周到几年;传代频繁：易污染、易变异因此，传代培养不适宜于菌种的长期保存，必须在传代保存的同时选择合适的长期的保存方法，防止菌种的退化和丢失。蚌埠学院食品与生物工程系117优点：方便使用，是一种基本的保存方法。蚌埠学院食品与生物（1）液氮:-196ºC是一种理想的长期保藏方法。但需专用器具，适用于专门的保藏机构。（2）低温冰箱：-20至-80ºC相对较长期的保藏方法，更为普遍。蚌埠学院食品与生物工程系118保护剂：胞内保护——甘油、二甲亚砜等小分子，透细胞；胞外保护——糊精、血清蛋白、脱脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮

休眠态冷冻：使微生物的代谢活动停止而达到保藏。（1）液氮:-196ºC蚌埠学院食品与生物工程系11沙土管法、滤纸片法(孢子保藏)尤其适合于产孢子的微生物以孢子的形式保藏孢子—耐干燥的休眠体蚌埠学院食品与生物工程系119微生物的几种孢子形式：（1）细菌的芽孢；（2）放线菌的孢子；（3）真菌的孢子休眠态干燥：使微生物的代谢活动停止而达到保藏。沙土管法、滤纸片法蚌埠学院食品与生物工程系119微生物的沙土管法、滤纸片法蚌埠学院食品与生物工程系120沙土管法、滤纸片法蚌埠学院食品与生物工程系120低温、缺氧和干燥蚌埠学院食品与生物工程系121多因素的组合，处于休眠状态，保藏时间长。处理过程对微生物的损伤小，存活率高，保藏效果好使用方便——保存、邮寄休眠态冷冻干燥——冷冻真空干燥。最普遍、最重要的的微生物保藏方法专业机构的主要菌种保藏手段低温、缺氧和干燥蚌埠学院食品与生物工程系121多因素的组蚌埠学院食品与生物工程系122蚌埠学院食品与生物工程系122由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用多种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。蚌埠学院食品与生物工程系123由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的蚌埠学院食品与生物工程系124思考题细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同？其典型生长曲线可分几期，其划分依据是什么？

蚌埠学院食品与生物工程系124思考题细菌的生长繁殖与高等蚌埠学院食品与生物工程系125第六章微生物的生长繁殖及其控制蚌埠学院食品与生物工程系1第六章微生物的生长繁殖及其控蚌埠学院食品与生物工程系126目的要求通过本章的课堂教学，了解微生物生长繁殖的规律，掌握微生物生长的测定方法，及各种物理、化学因素对微生物生长的影响。

蚌埠学院食品与生物工程系2目的要求通过本章的课堂教学，了蚌埠学院食品与生物工程系127教学内容(4学时)生物生长的测定以数量变化对微生物生长情况进行测定以生物量为指标测定微生物的生长细菌的群体生长繁殖生长曲线同步培养连续培养微生物生长繁殖的控制控制微生物的化学物质控制微生物的物理因素蚌埠学院食品与生物工程系3教学内容(4学时)生物生长的测蚌埠学院食品与生物工程系128第一节微生物生长的测定蚌埠学院食品与生物工程系4第一节微生物生长的测定微生物生长表现为微生物数量或质量的变化，通过此类指标测定可以了解微生物的生长状况，如：评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律等蚌埠学院食品与生物工程系129微生物生长表现为微生物数量或质量的变化，通过此类指标测定可以一、计数法可用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的孢子计数。蚌埠学院食品与生物工程系130一、计数法可用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的1.显微镜直接计数法利用血球计数板或细菌计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积的样品中微生物的数量）。蚌埠学院食品与生物工程系131细菌计数板常用于原核生物血球计数板可用于原核生物和真核生物1.显微镜直接计数法利用血球计数板或细菌计数板，在显微镜下对血球计数板计数室（容积）体积=1x0.1mm3=10-4mL计数室小格数=400个=25x16or16x25每毫升原液中细菌数(cell/mL)=[(每小格平均细菌数x400)/0.1mm3]x稀释倍数=每小格平均细菌数x400x10000x稀释倍数=每小格平均细菌数x稀释倍数x4x106蚌埠学院食品与生物工程系132血球计数板蚌埠学院食品与生物工程系8蚌埠学院食品与生物工程系133蚌埠学院食品与生物工程系9细菌计数板计数室（容积）体积=1x0.02mm3=2x10-5mL(cm3)计数室中方格数=25个每毫升原液中细菌数(cell/mL)=[(每中方格平均细菌数x25)/0.02mm3]x稀释倍数=每中方格平均细菌数x25x5x104x稀释倍数=每中方格平均细菌数x稀释倍数x1.25x106蚌埠学院食品与生物工程系134细菌计数板蚌埠学院食品与生物工程系10优点：快速简便，还可以知道细胞的大小和形态特征。缺点：需要相对高的细菌浓度（不适合低浓度菌体溶液）；不进行特殊染色时，不能区分死菌与活菌,所计为总菌数；不适于对运动细菌的计数；

个体小的细菌在显微镜下难以观察。（用细菌计数板比血球计数板更合适）蚌埠学院食品与生物工程系135优点：快速简便，还可以知道细胞的大小和形态特征。蚌埠学院采用特定的染色技术也可对活菌和死菌分别进行计数，如利用美兰染液可进行酵母的活菌计数。蚌埠学院食品与生物工程系136采用特定的染色技术也可对活菌和死菌分别进行计数，如利用美兰染对运动细菌的计数：通过加入甲醛等物质先破坏其运动性，然后进行计数。蚌埠学院食品与生物工程系137个体小的细菌在显微镜下难以观察用细菌计数板比血球计数板更合适;结合染色、相差显微镜及荧光显微镜计数。对运动细菌的计数：通过加入甲醛等物质先破坏其运动性，然后进行当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数。蚌埠学院食品与生物工程系138当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品2、间接计数法—活菌计数法通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、酵母菌、孢子）蚌埠学院食品与生物工程系1392、间接计数法—活菌计数法通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微（1）平板菌落计数法—活菌计数法原理：每一个单个的微生物细胞在合适的培养基和生长条件下，可以在平板上通过生长形成菌落。通过菌落数量的计数，计算样品中的活菌数。其方法流程如下：蚌埠学院食品与生物工程系140（1）平板菌落计数法—活菌计数法原理：每一个单个的微生物细胞蚌埠学院食品与生物工程系141蚌埠学院食品与生物工程系17蚌埠学院食品与生物工程系142蚌埠学院食品与生物工程系18蚌埠学院食品与生物工程系143蚌埠学院食品与生物工程系19（2）膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计（CFU/ml)。蚌埠学院食品与生物工程系144（2）膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、二、生物量（质量）的测定1、重量法蚌埠学院食品与生物工程系145(1)直接以菌体的干重/湿重衡量微生物群体的生物量；(2)通过样品中含量稳定的细胞组分，如蛋白质、核酸含量的测定，间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状的放线菌和真菌生长情况的有效方法二、生物量（质量）的测定1、重量法蚌埠学院食品与生物工程蚌埠学院食品与生物工程系146蚌埠学院食品与生物工程系222、比浊法该方法快速、灵敏应当注意的是：细胞应当呈分散的均匀状生长，实验测量应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。蚌埠学院食品与生物工程系1472、比浊法该方法快速、灵敏蚌埠学院食品与生物工程系23蚌埠学院食品与生物工程系148蚌埠学院食品与生物工程系243、生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的生长成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。蚌埠学院食品与生物工程系1493、生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、蚌埠学院食品与生物工程系150第二节细菌的群体生长繁殖

微生物的个体生长与同步生长单细胞微生物的生长曲线微生物的连续培养微生物的高密度培养蚌埠学院食品与生物工程系26第二节细菌的群体生长繁殖蚌埠学院食品与生物工程系151蚌埠学院食品与生物工程系27基本概念：分批培养是微生物培养的一种方式。指的是在三角瓶或者发酵罐等培养容器中，放入一定量的培养基，接种微生物细胞，置于合适的条件下进行培养。整个培养过程中，既没有新鲜培养基的加入，也没有内部培养物的移出，最后一次性收获细胞或者代谢产物的培养过程。蚌埠学院食品与生物工程系152基本概念：分批培养蚌埠学院食品与生物工程系28基本概念：分批培养在分批培养的条件下，微生物在封闭的系统中进行生长，导致营养物质消耗，浓度降低；代谢产物的产生以及代谢废物的积累。——内部是一个不断变化的环境，又是如何影响其中的微生物的生长？蚌埠学院食品与生物工程系153对分批培养条件下的微生物生长进行测定：——定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以细胞数量的对数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间生长规律的曲线。基本概念：分批培养蚌埠学院食品与生物工程系29对分批培养蚌埠学院食品与生物工程系154蚌埠学院食品与生物工程系30一、生长曲线蚌埠学院食品与生物工程系155一、生长曲线蚌埠学院食品与生物工程系31蚌埠学院食品与生物工程系156典型生长曲线培养时间(h)I延滞期II指数期III稳定期IV衰亡期0生长速度总菌数活菌数IIIIIIIVlg细胞数(个/ml)蚌埠学院食品与生物工程系32典型生长曲线培养时间(h)I蚌埠学院食品与生物工程系1571、延滞期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。蚌埠学院食品与生物工程系331、延滞期将少量菌种接入新鲜细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。蚌埠学院食品与生物工程系158细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。蚌埠学院食品与生物工程系159代谢调整迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；利用对数生长期的细胞作为种子；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量。蚌埠学院食品与生物工程系160在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：通过遗传学方法改变种的遗传2、对数生长期又称：指数生长期，其特点：细胞以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈指数方式增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。蚌埠学院食品与生物工程系1612、对数生长期又称：指数生长期，其特点：蚌埠学院食品与生3、稳定生长期由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。蚌埠学院食品与生物工程系1623、稳定生长期由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化稳定生长期：是细胞重要的分化调节阶段，如芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，如某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。是以细胞生产为目的的最适收获阶段。蚌埠学院食品与生物工程系163稳定生长期：蚌埠学院食品与生物工程系394、衰亡期营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。蚌埠学院食品与生物工程系1644、衰亡期营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。蚌埠学院食品与生物工程系165由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准二、指数生长期中几个重要的生长参数指数生长期其特点：细胞生长速率最大，细菌数量呈指数增加；细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长；对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致；代谢旺盛、生长迅速、代时稳定。所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。蚌埠学院食品与生物工程系166二、指数生长期中几个重要的生长参数指数生长期其特点：蚌埠学院1、世代数从t0

到t时间内微生物繁殖了多少代？---n代蚌埠学院食品与生物工程系167Nt=N0·2n两边取对数：logNt=logN0+nlog2n=[logNt-logN0]/log2=[logNt-logN0]/3.3221、世代数从t0到t时间内微生物繁殖了多少代？---n2、代时在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间--------代时通常以G表示。假设，从时间t0

到t，细菌繁殖n代，则：蚌埠学院食品与生物工程系168G=(t-t0)/n

=3.322(t-t0)/

[logNt-logN0]2、代时在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，在3、平均生长速度常数分批培养中，生长速度用平均生长速度常数（R）表示，单位时间内的世代数（单位时间里微生物繁殖的代数）。假设，从时间t0

到t，细菌繁殖n代，则：蚌埠学院食品与生物工程系169R=n/(t-t0)=3.322[logNt-logN0]/(t-t0)

3、平均生长速度常数分批培养中，生长速度用平均生长速度常数（影响微生物增代时间（代时）的因素：菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。蚌埠学院食品与生物工程系170影响微生物增代时间（代时）的因素：蚌埠学院食品与生物工程蚌埠学院食品与生物工程系171一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes 组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉汤 37 48Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200蚌埠学院食品与生物工程系47一些细菌的代时菌名 培养基 蚌埠学院食品与生物工程系172不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：

E.Coli在不同温度下的代时温度（℃） 代时（分） 温度（℃） 代时（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77蚌埠学院食品与生物工程系48不同温度下的代时温度对微生物凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。限制性因子多是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐在低浓度下，既影响生长速度也影响产量。蚌埠学院食品与生物工程系173凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生蚌埠学院食品与生物工程系1748.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量蚌埠学院食品与生物工程系508.0mg/ml只最大收生长三、同步培养使群体中的细胞处于比较一致的同样的生长发育阶段上，使大多数细胞达到同时进行生长或分裂的培养方法，称为同步培养。蚌埠学院食品与生物工程系175通过同步培养方法获得的细胞被称为----同步细胞或同步培养物同步细胞处于同一生长阶段，进行培养时能够同时进行生长和分裂，这种生长方式称为同步生长。三、同步培养使群体中的细胞处于比较一致的同样的生长发育阶段上1、同步培养的方法—获得同步生长细胞的方法蚌埠学院食品与生物工程系1761、同步培养的方法—获得同步生长细胞的方法蚌埠学院食品与硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步细胞的方法蚌埠学院食品与生物工程系177硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步细胞的方法蚌埠学院食品2、同步生长蚌埠学院食品与生物工程系178同步生长：表现为阶梯式的曲线；随机生长：表现为直线由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。2、同步生长蚌埠学院食品与生物工程系54同步生长：表现为典型生长曲线反映的是分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）时的生长规律。蚌埠学院食品与生物工程系179将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。培养基一次加入，不予补充，不再更换，导致出现稳定期和衰亡期。我们的期望：长期保持对数生长期的平衡生长状态。典型生长曲线反映的是分批培养（batchculture）o四、连续培养在分批培养达到对数期的后期时，采用不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物的措施，达到一种动态平衡，使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去。——连续培养(Continousculture）蚌埠学院食品与生物工程系180四、连续培养在分批培养达到对数期的后期时，采用不断的补充营养蚌埠学院食品与生物工程系181蚌埠学院食品与生物工程系57蚌埠学院食品与生物工程系1821、恒浊连续培养一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的所用培养基中不含有限制性必需营养物，可以使菌体维持最高的生长速率，获得最大生长量。蚌埠学院食品与生物工程系581、恒浊连续培养一种根据培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业蚌埠学院食品与生物工程系183（连续发酵）缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；连续发酵与单批发酵相比的优点：缺点：杂菌污染和菌种退化一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业蚌埠学2.恒化连续培养保持培养液流速不变，控制培养基中某种营养物质（生长限制性因子）浓度基本恒定的方式。蚌埠学院食品与生物工程系184恒化连续培养中，通常将微生物的某种必需营养物质控制在较低的浓度，以作为生长限制性因子，而其他营养物均过量，细菌的生长速率取决于生长限制性因子的浓度，并低于最高生长速率。限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。2.恒化连续培养保持培养液流速不变，控制培养基中某种营养物营养物浓度与生长速率、产量的关系蚌埠学院食品与生物工程系185在一定浓度下，通过控制流速可以得到不同生长速率的培养物营养物浓度与生长速率、产量的关系蚌埠学院食品与生物工程系基本参数以及相互关系：f:培养液的流加速度(L/h)V:培养器中培养液的有效体积D:稀释率，D=f/V(h-1)，代表营养物质的更新速度，或者培养基每小时流过培养容器的有效体积.蚌埠学院食品与生物工程系186基本参数以及相互关系：蚌埠学院食品与生物工程系62蚌埠学院食品与生物工程系187在恒化连续培养系统中：微生物的数量和代时都与稀释率（D）有关。蚌埠学院食品与生物工程系63在恒化连续培养系统中：微生物净增细菌数：dN=N-DN=(–D)N与D的关系决定该连续培养的状态与菌数变化规律：>D：菌数净增，消耗营养，积累产物，趋向于分批培养（不可实现，因为比生长速度受到生长限制性因子的控制）；=D：连续培养达到平衡状态，菌数维持在恒定水平；<D：菌数被稀释，直到完全洗出。蚌埠学院食品与生物工程系188培养容器中细菌数的变化包括2方面：增加速率:dN/dt=μN;减少速率：dN/dt=DN净增细菌数：dN=N-DN=(–D)恒化连续培养与恒浊连续培养的比较在恒浊连续培养中，参量稀释速度在不断地变化；而恒化连续培养中，该参数为一恒定值。在恒浊连续培养中，培养基中不存在生长限制因素。恒浊连续培养在高稀释速度下运行最好，恒化连续培养在低稀释速度下最稳定有效。蚌埠学院食品与生物工程系189恒化连续培养与恒浊连续培养的比较在恒浊连续培养中，参量稀释速蚌埠学院食品与生物工程系190第三节微生物生长繁殖的控制蚌埠学院食品与生物工程系66第三节微生物生长繁殖的控制一、影响微生物生长繁殖的环境因素营养物质水活度温度pH氧蚌埠学院食品与生物工程系191温度pH氧一、影响微生物生长繁殖的环境因素营养物质蚌埠学院食品与生1、温度最适生长温度：代时最短或者生长速率最高时的培养温度。蚌埠学院食品与生物工程系192生长温度三基点1、温度最适生长温度：代时最短或者生长速率最高时的培养温度。蚌埠学院食品与生物工程系193蚌埠学院食品与生物工程系69微生物可生长温度范围的广泛性（p148，表6-3）蚌埠学院食品与生物工程系194微生物可生长温度范围的广泛性（p148