色谱毛细管电泳法课件

第三章毛细管电泳法姚彤炜1第三章毛细管电泳法姚彤炜1概述毛细管电泳又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是80年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是电泳技术与层析技术相结合的产物广泛用于生物大分子，手性药物，生物体内的药物及代谢物，中西药物及其制剂等的分析，在选择性上与高效液相法有很大的互补性被多国药典收载，如2010年版中国药典对盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检查，USP对盐酸罗哌卡因的对映体纯度检查，均采用毛细管电泳法测定2概述毛细管电泳又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是80年代初一、基本原理高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类技术在毛细管电泳中有两个重要的迁移：电泳迁移电渗流迁移3一、基本原理高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛细管为分离电泳迁移在电场作用下，带电组分作定向移动。其迁移速度（）可用下式表示：

=eE（1）e为电泳淌度E为电场强度（V/L）——是外加电压和毛细管长度的函数4电泳迁移在电场作用下，带电组分作定向移动。其迁移速度（）可电泳迁移原理对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特征常数，其大小取决于分子所受的电场力FE和其通过介质时的摩擦力FF的平衡：FE

=qE

（q为离子电量）FF=－6r

（溶液粘度,r离子半径,离子速度）达到平衡时，两种力大小相等而方向相反，即qE=6r（2）5电泳迁移原理对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特征常数，电泳迁移原理根据式(1)=eE

，淌度e=/E

根据式(2)qE=6r，/E=q/(6r)所以e=q/(6r)（3）式（3）表明，带电量大的物质，离子半径小的物质有较高的淌度6电泳迁移原理根据式(1)=eE，淌度e=/E6淌度淌度——物理常数，是在溶质带最大电量时测定并外推至无限稀释条件下的数值，即绝对淌度有效淌度——实验条件下测得的数值，其取决于操作缓冲液的pH值和组成7淌度淌度——物理常数，是在溶质带最大电量时测定并外推至无限稀溶液pH值对淌度的影响若两种溶质在完全离子化状态下，具有相同的电泳淌度，则因没有差速迁移而不能分离但若它们具有不同的pKa值，则可调节溶液pH值，使他们具有不同的有效淌度，而达到分离的目的8溶液pH值对淌度的影响若两种溶质在完全离子化状态下，具有相同电渗流（EOF）毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体整体流动的现象，是推动流体前进的驱动力当固体与液体接触时，固-液两相界面上会带有相反符号的电荷，形成双电层。对于石英毛细管柱，当溶液pH值达4以上时，其内壁带负电荷，管中液体将感应一层正电荷，形成双电层，在高电压作用下缓冲液整体向负极移动，此即电渗流(eof)9电渗流（EOF）毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表面电渗流在电场作用下电渗流作用示意图10电渗流在电场电渗流作用示意图10电渗流性质电渗流的一个独特性质是其具有平面流型，推动液体流动的力在毛细管内均匀分布，平面流型的优点是对谱带的扩散没有直接作用11电渗流性质电渗流的一个独特性质是其具有平面流型，推动液体流动带电微粒在毛细管内的移动的速度带电微粒在毛细管内的移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。

=(e+eof）V/L一般情况下，电渗流的方向是由正极向负极移动，而电渗流的速度又远大于电泳流故所有组分均向同一方向——阴极移动，但速度各不相同12带电微粒在毛细管内的移动的速度带电微粒在毛细管内的移动的速度淌度与迁移时间式中L为毛细管总长度，l为毛细管有效长度（进样点到检测器距离），V为电压当L，l，V一定时，Tm与e成反比Lle

VTm=13淌度与迁移时间式中L为毛细管总长度，l为毛细管有效长度（进电渗流后的迁移时间Tm=L·l/（e+eof）·V（e+eof）称为表观淌度a（即在电渗流存在下测得的淌度）溶质从进样点迁移至检测点所用的时间称为“迁移时间(t)”，根据上式可计算溶质的表观淌度：a

=e＋eof=L·l/t·V当L、l、V一定时，a与t成反比14电渗流后的迁移时间Tm=L·l/（e+eof）·二、分离度与理论板数分离度R=Z/4

（Z为两峰间距，为峰标准差）理想条件下理论板数n与电压V的关系可表示为：N=（e＋

eof）·V·l/2DL（式中D为扩散系数）D值小的大分子扩散小，柱效高在高电场下(V值大)，溶质在毛细管内停留时间短，扩散小，柱效高W=42（tR2-tR1）W1+W2R=在实际工作中，按HPLC方法求得理论板数：N=5.54（t/w1/2）215二、分离度与理论板数分离度R=Z/4W=4影响分离效率的因素焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、外加电压等影响不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引起区带展宽。温度变化1℃→黏度变化2%～3%→淌度变化2%～3%进样塞长度——在进样过程中减少样品塞长度非常重要。对进样长度的限制是低于毛细管总长度的（1～2）%。例70cm长的毛细管，进样量应小于7mm16影响分离效率的因素焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称为影响分离效率的因素溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发生对溶质的完全吸附。对多肽和蛋白质来说，这种吸附特别严重。可采用多种方法来减少相互作用：增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷在极端pH值下进行分离，使石英表面硅羟基以不带电的形式存在对毛细管壁进行涂层处理电分散作用——样品区带与操作缓冲液的电导差异可产生峰型畸变17影响分离效率的因素溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发生◎◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎bufferbuffer＋＋＋－－－低电导等电导高电导样品区带样品区带样品区带溶质电导高于缓冲液，产生前沿峰溶质电导低于缓冲液，产生拖尾峰◎◎样品与缓冲液电导不匹配引起的电分散18◎◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎◎◎buff方式分离依据毛细管区带电泳（CZE）自由溶液的淌度胶束电动色谱（MECC）疏水性/离子性相互作用毛细管凝胶色谱（CGE）分子大小/电荷毛细管等电聚焦（CIEF）等电点毛细管等速电泳（CITP）移动界面毛细管电色谱（CEC）样品与固定相间相互作用三、分离模式毛细管电泳的操作方式有多种，分离机制各不相同，常用的分离模式有：19方式毛细管区带电泳（CZE）CZE是应用最广泛的一种技术，在毛细管内充满缓冲液，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，根据迁移速度不同而达到分离缓冲液选择因电渗流（EOF）对pH值很敏感，故要求采用缓冲液来维持恒定的pH值20毛细管区带电泳（CZE）CZE是应用最广泛的一种技术，在毛细对缓冲液的要求强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度。常用的缓冲液有Tris（三羟甲基氨基丙烷），硼酸盐，磷酸盐等缓冲液的pH值当测定多肽、蛋白质等时，由于溶质的pI值相接近，此时调节缓冲液的pH值对分离特别有用。在高于或低于溶质的pI值情况下操作，可使溶质所带电荷改变，从而在EOF前或后流出21对缓冲液的要求强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度。21表面活性剂在毛细管电泳中常添加表面活性剂，作为疏水性溶质的增溶剂、与溶质形成离子对，或作为毛细管内壁的改性剂等，以改善分离效率。常用表面活性剂有：阴离子—十二烷基硫酸钠（SDS）阳离子---十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）两性离子---N,N’二甲基胺-3-丙烷-1-磺酸22表面活性剂在毛细管电泳中常添加表面活性剂，作为疏水性溶质的增手性选择剂在操作缓冲液中加入少量手性试剂可以实现手性分离。常用的手性试剂有：环糊精、冠醚、胆汁盐等选择手性试剂的种类、浓度或添加醇类、表面活性剂、金属离子等可提高选择性 23手性选择剂在操作缓冲液中加入少量手性试剂可以实现手性分离。常温度与毛细管内壁改性温度——恒温是消除焦耳热的主要目的，但温度也可作为一个优化分离的参数。通过调节温度来改变溶液黏度、EOF和分析时间，以达到分离目的毛细管内壁改性——在分离生物大分子物质如蛋白质时，由于它们可被毛细管内壁强烈吸附,使分离效率大大降低。需对毛细管内壁改性：永久性改性——硅烷化动力学去活——操作缓冲液中加改性剂24温度与毛细管内壁改性温度——恒温是消除焦耳热的主要目的，但温例氯苄律定对映体在家兔体内药代动力学研究电泳条件：羧甲基环糊精衍生物(CM--CD)为手性拆分剂,最佳浓度5mmol/L毛细管柱48cm58m75mmol/L磷酸盐缓冲液（pH2.3）UV检测波长200nm电迁移进样(20kV16s)电压20kV,柱温20C25例氯苄律定对映体在家兔体内药代动力学研究电泳条件：25讨论：用酸性缓冲液体系，有效控制了毛细管内电渗流电迁移进样可以消除血浆中酸性或中性内源性物质的干扰，使被测物有选择地进样采用柱上场放大堆积浓集样品，在进样前先在毛细管进样口引入一个短的稀缓冲液水柱，因样品离子的电泳速度与电场强度成正比，故使样品塞中离子堆积在高浓度缓冲液界面上从结构看，本品手性碳藏于四环体系中，用一般的CD难以分离两对映体，衍生酸性羧甲基后可与药物的碱性基团发生静电吸引，有利于手性识别26讨论：用酸性缓冲液体系，有效控制了毛细管内电渗流26胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）MECC是电泳技术与色谱技术的交叉，也是唯一既能分离中性物质又能分离带电组分的电泳技术。把表面活性剂加到缓冲液中，在表面活性剂的临界浓度以上，单个表面活性剂之间聚集形成胶束。疏水性一端聚在一起朝向里，带电荷的一端则朝向缓冲液27胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）MECC是电泳技术与MECC的作用原理表面活性剂分子和胶束通常是带电的，以与EOF相同或相反的方向移动，但EOF的移动速度一般较胶束快

28MECC的作用原理表面活性剂分子和胶束通常是带电的，以与EO选择性与分离度通过选择不同的表面活性剂，改变缓冲液浓度、pH值和操作温度，使用添加剂（尿素、金属离子、手性试剂），加入有机修饰剂（甲醇、乙腈、异丙醇）等来控制溶质与胶束之间的相互作用，以提高色谱的选择性在分离中性物质时，所有溶质都在t0与tm之间流出。亲水性溶质随EOF流出，被胶束完全保留的溶质随胶束流出。控制条件，采用中等程度的EOF和高迁移率的胶束，以扩大时间窗口，提高分离度29选择性与分离度通过选择不同的表面活性剂，改变缓冲液浓度、pH时间窗口

t0

tR1tR2tR3

tm胶束EOF

t0

tm溶质中性溶质的流出时间窗口示意图30时间窗口t0tR1例1兔血浆中氟比洛芬的测定电泳条件：75m100cm毛细管柱分离电压30kV,温度30C°虹吸进样30sUV检测波长254nm分离缓冲液为20mmol/L硼砂含25mmol/LSDS,pH9.02讨论:硼砂缓冲液中加入SDS可包裹血浆中蛋白质，减少蛋白质对分离测定的干扰和对柱的污染空白血浆血样内标31例1兔血浆中氟比洛芬的测定电泳条件：空白血浆血样内标31例2高效毛细管电泳法测定注射用水溶性维生素的含量

采用胶束电动毛细管色谱法，分离分析注射用水溶性维生素制剂中VB1、VB12、VB6、VC、烟酰氨、叶酸、D-生物素、核黄素磷酸钠、泛酸钠9种成分电泳条件：未涂层熔融石英毛细管(67cm×50m，有效长度55cm)运行缓冲液为50mmol/LSDS-50mmol/L的硼酸钠（pH8.33）检测波长214nm压力进样（6.89KPa×10s）运行电压15.0kV；毛细管柱温25℃32例2高效毛细管电泳法测定注射用水溶性维生素的含量采用胶束分析前毛细管处理每天分析之前，分别依次用1mol/L氢氧化钠溶液、高纯水、运行缓冲液冲洗5,10,10min每次分析之间分别用0.1mol/L氢氧化钠溶液、高纯水、运行缓冲液冲洗毛细管3,5,5min33分析前毛细管处理每天分析之前，分别依次用1mol/L氢氧化测定方法取约1.5g的内容物，精密称定，置于10ml量瓶中，用水冲洗瓶内壁，洗液与样品合并，加水溶解并稀释至刻度，混匀。用0.22m微孔滤膜过滤后，在上述电泳条件下进样，记录维生素B12和D-生物素的峰面积另精密量取上述样品溶液1.0ml,置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，同法测定，记录VB1,VB6,VC、烟酰氨、叶酸、核黄素磷酸钠、泛酸钠的峰面积，按外标法计算样品含量34测定方法取约1.5g的内容物，精密称定，置于10ml量瓶中，测定结果测得各种成分按标示量计算的百分含量（%）在97.5±0.9到103.8±0.7之间（n=3）制剂中9种成分的毛细管电泳图如下：1-烟酰氨；2-VB6；3-D-生物素；4-核黄素磷酸钠；5-VB12；6-VC；7-泛酸钠；8-叶酸；9-VB1混合对照液制剂35测定结果测得各种成分按标示量计算的百分含量（%）在97.5±毛细管电色谱（CEC）将HPLC中的固定相填充到毛细管中作为固定相，以电渗流为流动相的驱动力，利用样品与固定相的相互作用的差异而达到分离HV分离柱检测器分流控制阀反压阀高压电源电极36毛细管电色谱（CEC）将HPLC中的固定相填充到毛细管中作为例氟西汀和西替利嗪对映体的双动态吸附毛细管电色谱手性分离以SO3--CD为手性选择剂，海美溴铵(HDB)为阳离子表面活性剂，在Tris-H3PO4(pH3.0)的体系中分离了氟西汀和西替利嗪对映体色谱条件毛细管柱35cm50m,有效长度30cm压力进样：13.8kPa4s；分离电压15kV紫外检测210nm；分离柱温25C37例氟西汀和西替利嗪对映体的双动态吸附毛细管电色谱手性分离以讨论采用HDB作添加剂使形成双动态涂层，反转电渗流，采用正极检测，大大缩短分析时间在20mmol/LTris-H3PO4(pH3.0)条件下，HDB含量0.1g/L，SO3--CD20mmol/L，氟西汀和西替利嗪对映体在较短的时间内达到良好分离pH2时石英毛细管壁的硅羟基不解离，即使加入HBD也无法形成双动态吸附。当pH增加到3时，硅羟基发生解离后而带负电，带正电的HBD通过静电作用在柱内形成第一动态涂层，而后再静电吸附一层负电性的SO3--CD，双动态吸附的形成导致分析物R值的增大38讨论采用HDB作添加剂使形成双动态涂层，反转电渗流，采用正极例梯度加压毛细管电色谱同时分离大黄提取液中5种蒽醌类化合物毛细管电色谱主要是以电驱动流动相为主要的分离模式，而压力流驱动毛细管电色谱是以液相色谱泵为流动相的主要驱动力，它克服了仅靠电渗流驱动的一些限制因素，可方便地对流动相的组成、性质和流速进行调节，尤其是能够实现流动相梯度洗脱，是毛细管电色谱法发展的重要方向39例梯度加压毛细管电色谱同时分离大黄提取液中5种蒽醌类化合物色谱条件C18熔硅毛细管柱（27cm75m），有效长度20cm流动相A组成：醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=4.5)；流动相B组成：乙腈流动相流速0.08mL/min进样阀定量进样20nL在260nmUV柱上检测-3kV电压下，大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸5种成分得到最好分离效果40色谱条件C18熔硅毛细管柱（27cm75m），有效长度AE为5种梯度（不加电压）在上述C梯度条件下，改变电压最佳分离结果41AE为5种梯度在上述C梯度条件下，改变电压最佳分离结果41多种色谱技术提供了不同的选择性42多种色谱技术提供了不同的选择性42四、毛细管电泳仪装置示意图43四、毛细管电泳仪装置示意图43进样进样体积一般是不知道的，进样量通常用压力与时间或电压与时间表示。（注意：样品区带的长度应不超过毛细管总长度的1%-2%）。方法有：流体力学方式在进样端加气压在出口端抽真空利用虹吸现象44进样进样体积一般是不知道的，进样量通常用压力与时间或电压与时虹吸抽真空流体动力加压气动进样示意图45虹吸抽真空流体动力加压气动进样示意图45电动进样用样品管替换缓冲液管，施加电压来完成进样。这种进样方式的进样量取决于组分的电泳淌度，对于离子型组分有进样歧视，迁移速度快的离子比迁移速度慢的离子进去得要多一些。46电动进样用样品管替换缓冲液管，施加电压来完成进样。这种进样方毛细管熔融石英毛细管有效长度为50～75cm，总长度一般比有效长度多5～15cm，内径为20～75m。毛细管使用前后需用碱液、缓冲液冲洗毛细管温度的控制对于操作重现性很重要，常采用液体恒温或空气恒温方式，前者比较有效，后者仪器装置简单、操作方便毛细管电泳所用高压电源要能提供30kV的直流电压和200～300A的电流。最好使用双极性电源，能进行极性切换47毛细管熔融石英毛细管有效长度为50～75cm，总长度一般比有泡状池示意图光源检测器毛细管电泳的检测方式是采用柱上检测，透光窗直接开在毛细管上，不存在死体积和组分混合而产生谱带展宽现象48泡状池示意图光源检测器毛细管电泳的检测方式是采用柱上检测，透五、毛细管电泳与其它技术联用毛细管电泳与其它技术联用拓宽了毛细管电泳的应用范围。例不同电泳技术间的联用（等速电泳与区带电泳联用，CITP-CZE）高效液相与毛细管电泳联用（HPLC-HPCE）毛细管电泳与质谱联用免疫分析与毛细管电泳联用——毛细管电泳免疫分析。利用抗原抗体复合物与游离抗原、抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为免疫分析的检测手段49五、毛细管电泳与其它技术联用毛细管电泳与其它技术联用拓宽了毛例1：毛细管液相/毛细管电泳二维系统小承气汤uHPLC:EP-250-80-5-C18(A)CH3OH;(B)H2OMEKC:36cmx75um30mMSDS,8mMNaBr,5mMK2HPO421kv210nm50例1：毛细管液相/毛细管电泳二维系统小承气汤50例2：二维毛细管电泳电化学检测尿样中的-阻断剂设计制作了在柱电化学(EC)检测池，用于在同一根毛细管中进行中心切割二维毛细管电泳(2D-CE)在线纯化分离检测尿样中的6种-阻断剂尿样先在15mmoL/LNaAc缓冲液中进行毛细管区带电泳(CZE)分离，带正电荷的-阻断剂与中性和带负电荷的干扰物质分成不同区带然后在检测端施加13.8kPa压力将干扰成分从毛细管入口端排出，同时将目标组分驱送到毛细管入口端51例2：二维毛细管电泳电化学检测尿样中的-阻断剂设计制作了在二维毛细管电泳电化学检测尿样中的-阻断剂最后在90mmoL/LNaAc-30mmoL/LSDS缓冲液中进行胶束电动毛细管色谱(MEKC)分离场放大样品堆积(FASS)／胶束推扫在柱双重富集技术不仅有效抵消压力驱送过程中产生的区带扩散，还可进一步压缩样品区带，提高检测灵敏度。52二维毛细管电泳电化学检测尿样中的-阻断剂最后在90mmoCE-EC在柱检测装置为在柱EC检测，制作了蚀刻场隔离接头。距毛细管出口端1.5cm处，用刀将毛细管一侧的聚酰亚胺涂层刮掉5mm，去掉涂层的部分毛细管放置在40％HF溶液中蚀刻3h形成一段多孔膜，在该处均匀涂敷一层醋酸纤维素浆，待凝固后，即形成只通过电流而无溶液泄漏的场隔离接头。53CE-EC在柱检测装置为在柱EC检测，制作了蚀刻场隔离接头。方法设计单纯采用MEKC，尿中共存组分，如尿酸、抗坏血酸、氨基酸等对6种-阻断剂测定有干扰根据6种-阻断剂都是弱碱性化合物（pKa=8.7-9.7），在pH4.3的NaAc-HAc缓冲液中带正电荷，电泳淌度与电渗流方向一致，在CZE条件下迁移较快，而部分干扰成分在该条件下为中性或阴离子化合物，迁移较慢。在90mmoL/LNaAc-HAc(pH4.3)缓冲液中，6种-阻断剂与干扰成分得到分离54方法设计单纯采用MEKC，尿中共存组分，如尿酸、抗坏血酸、氨MEKC与CZE分离色谱图55MEKC与CZE分离色谱图552D-CE在线纯化分离尿样中-阻断剂的方法毛细管内先充满CZE15mmol/LNaAc-HAc缓冲液，10kV电动进样10s，鼠尿样品在l0kV下进行CZE分离。当工作电极检测到-阻断剂的信号时立即停止分离电压；检测端换为MEKC90mmol/LNaAc-HAc-30mmol/LSDS缓冲液，并在检测端施加13.8kPaN2压力，溶液以0.2cm/s的速度流向进样端，干扰物质从进样端排出毛细管，根据毛细管有效长度(59.5cm)和液流速度(0.2cm/s),-阻断剂在298s时到达进样端(为防止损失,290s时停止N2压力);同时MEKC缓冲溶液进入毛细管中。进样端换成MEKC缓冲溶液，-阻断剂在10kV下进行MEKC分离。经一维CZE分离纯化后，二维MEKC分离待测物时无干扰峰。562D-CE在线纯化分离尿样中-阻断剂的方法毛细管内先充满C双重富集作用第二维分离第一维至第1个峰被检出压力驱送过程MEKC放大图FASS和推扫双重富集第一维分离结束后，待测组分处于15mmol/LNaAc-HAc缓冲液中，离子强度远低于第二维背景缓冲液(90mmol/LNaAc-HAc-30mmol/LSDS)，在缓冲液界面处进行FASS的同时被迎面而来的SDS胶束捕获，使样品区带得到双重压缩57双重富集作用第二维分离第一维至第1个峰被检出压力驱送过程ME例3：毛细管电泳等离子体原子发射光谱测定人血浆中游离钙离子的含量应用毛细管电泳-电感耦合等离子体原子发射光谱联用技术对人体血浆中钙元素的形态进行分析，对游离钙离子进行了定位表征与定量分析在电泳缓冲溶液为30mmol/LTris-HCl(pH=7.4)及电泳电压为20kV的条件下，得到人体血浆中钙的主要形态有8种，其中一种为游离钙离子58例3：毛细管电泳等离子体原子发射光谱测定人血浆中游离钙离子的毛细管电泳等离子体原子发射光谱（CE-ICP-AES）测定人血浆中游离钙离子的含量测定条件：ICP-AES功率1100W，载气(Ar)流0.8L/min，轴向观测。元素分析线Ca393.366nm，毛细管电泳分离条件：毛细管120cm×100m，电压20kV，压力进样0.04MPa×10S，30mmol/LTris-HCI缓冲溶液(pH7.4)59毛细管电泳等离子体原子发射光谱（CE-ICP-AES）测定人血浆样品制备血浆制备:空腹抽取人静脉血5mL，注入内装抗凝剂肝素钠的离心管中，混合均匀后，以4000r/min离心10min，取上层血浆，4℃保存。血浆中钙的总含量测定：移取0.50mL血浆于25mL烧杯中，加入2.5mL浓HNO，和1mL30％的H202，混匀，盖上表面皿，静置过夜后在电炉上微热至近干，冷却，加入1mL亚沸水和1mL浓HCI，微热至近沸，冷却后，定容于50mL容量瓶中进行ICP-AES测定。60血浆样品制备血浆制备:空腹抽取人静脉血5mL，注入内装抗凝第三章毛细管电泳法姚彤炜61第三章毛细管电泳法姚彤炜1概述毛细管电泳又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是80年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是电泳技术与层析技术相结合的产物广泛用于生物大分子，手性药物，生物体内的药物及代谢物，中西药物及其制剂等的分析，在选择性上与高效液相法有很大的互补性被多国药典收载，如2010年版中国药典对盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检查，USP对盐酸罗哌卡因的对映体纯度检查，均采用毛细管电泳法测定62概述毛细管电泳又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是80年代初一、基本原理高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类技术在毛细管电泳中有两个重要的迁移：电泳迁移电渗流迁移63一、基本原理高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛细管为分离电泳迁移在电场作用下，带电组分作定向移动。其迁移速度（）可用下式表示：

=eE（1）e为电泳淌度E为电场强度（V/L）——是外加电压和毛细管长度的函数64电泳迁移在电场作用下，带电组分作定向移动。其迁移速度（）可电泳迁移原理对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特征常数，其大小取决于分子所受的电场力FE和其通过介质时的摩擦力FF的平衡：FE

=qE

（q为离子电量）FF=－6r

（溶液粘度,r离子半径,离子速度）达到平衡时，两种力大小相等而方向相反，即qE=6r（2）65电泳迁移原理对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特征常数，电泳迁移原理根据式(1)=eE

，淌度e=/E

根据式(2)qE=6r，/E=q/(6r)所以e=q/(6r)（3）式（3）表明，带电量大的物质，离子半径小的物质有较高的淌度66电泳迁移原理根据式(1)=eE，淌度e=/E6淌度淌度——物理常数，是在溶质带最大电量时测定并外推至无限稀释条件下的数值，即绝对淌度有效淌度——实验条件下测得的数值，其取决于操作缓冲液的pH值和组成67淌度淌度——物理常数，是在溶质带最大电量时测定并外推至无限稀溶液pH值对淌度的影响若两种溶质在完全离子化状态下，具有相同的电泳淌度，则因没有差速迁移而不能分离但若它们具有不同的pKa值，则可调节溶液pH值，使他们具有不同的有效淌度，而达到分离的目的68溶液pH值对淌度的影响若两种溶质在完全离子化状态下，具有相同电渗流（EOF）毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体整体流动的现象，是推动流体前进的驱动力当固体与液体接触时，固-液两相界面上会带有相反符号的电荷，形成双电层。对于石英毛细管柱，当溶液pH值达4以上时，其内壁带负电荷，管中液体将感应一层正电荷，形成双电层，在高电压作用下缓冲液整体向负极移动，此即电渗流(eof)69电渗流（EOF）毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表面电渗流在电场作用下电渗流作用示意图70电渗流在电场电渗流作用示意图10电渗流性质电渗流的一个独特性质是其具有平面流型，推动液体流动的力在毛细管内均匀分布，平面流型的优点是对谱带的扩散没有直接作用71电渗流性质电渗流的一个独特性质是其具有平面流型，推动液体流动带电微粒在毛细管内的移动的速度带电微粒在毛细管内的移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。

=(e+eof）V/L一般情况下，电渗流的方向是由正极向负极移动，而电渗流的速度又远大于电泳流故所有组分均向同一方向——阴极移动，但速度各不相同72带电微粒在毛细管内的移动的速度带电微粒在毛细管内的移动的速度淌度与迁移时间式中L为毛细管总长度，l为毛细管有效长度（进样点到检测器距离），V为电压当L，l，V一定时，Tm与e成反比Lle

VTm=73淌度与迁移时间式中L为毛细管总长度，l为毛细管有效长度（进电渗流后的迁移时间Tm=L·l/（e+eof）·V（e+eof）称为表观淌度a（即在电渗流存在下测得的淌度）溶质从进样点迁移至检测点所用的时间称为“迁移时间(t)”，根据上式可计算溶质的表观淌度：a

=e＋eof=L·l/t·V当L、l、V一定时，a与t成反比74电渗流后的迁移时间Tm=L·l/（e+eof）·二、分离度与理论板数分离度R=Z/4

（Z为两峰间距，为峰标准差）理想条件下理论板数n与电压V的关系可表示为：N=（e＋

eof）·V·l/2DL（式中D为扩散系数）D值小的大分子扩散小，柱效高在高电场下(V值大)，溶质在毛细管内停留时间短，扩散小，柱效高W=42（tR2-tR1）W1+W2R=在实际工作中，按HPLC方法求得理论板数：N=5.54（t/w1/2）275二、分离度与理论板数分离度R=Z/4W=4影响分离效率的因素焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、外加电压等影响不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引起区带展宽。温度变化1℃→黏度变化2%～3%→淌度变化2%～3%进样塞长度——在进样过程中减少样品塞长度非常重要。对进样长度的限制是低于毛细管总长度的（1～2）%。例70cm长的毛细管，进样量应小于7mm76影响分离效率的因素焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称为影响分离效率的因素溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发生对溶质的完全吸附。对多肽和蛋白质来说，这种吸附特别严重。可采用多种方法来减少相互作用：增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷在极端pH值下进行分离，使石英表面硅羟基以不带电的形式存在对毛细管壁进行涂层处理电分散作用——样品区带与操作缓冲液的电导差异可产生峰型畸变77影响分离效率的因素溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发生◎◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎bufferbuffer＋＋＋－－－低电导等电导高电导样品区带样品区带样品区带溶质电导高于缓冲液，产生前沿峰溶质电导低于缓冲液，产生拖尾峰◎◎样品与缓冲液电导不匹配引起的电分散78◎◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎◎◎buff方式分离依据毛细管区带电泳（CZE）自由溶液的淌度胶束电动色谱（MECC）疏水性/离子性相互作用毛细管凝胶色谱（CGE）分子大小/电荷毛细管等电聚焦（CIEF）等电点毛细管等速电泳（CITP）移动界面毛细管电色谱（CEC）样品与固定相间相互作用三、分离模式毛细管电泳的操作方式有多种，分离机制各不相同，常用的分离模式有：79方式毛细管区带电泳（CZE）CZE是应用最广泛的一种技术，在毛细管内充满缓冲液，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，根据迁移速度不同而达到分离缓冲液选择因电渗流（EOF）对pH值很敏感，故要求采用缓冲液来维持恒定的pH值80毛细管区带电泳（CZE）CZE是应用最广泛的一种技术，在毛细对缓冲液的要求强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度。常用的缓冲液有Tris（三羟甲基氨基丙烷），硼酸盐，磷酸盐等缓冲液的pH值当测定多肽、蛋白质等时，由于溶质的pI值相接近，此时调节缓冲液的pH值对分离特别有用。在高于或低于溶质的pI值情况下操作，可使溶质所带电荷改变，从而在EOF前或后流出81对缓冲液的要求强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度。21表面活性剂在毛细管电泳中常添加表面活性剂，作为疏水性溶质的增溶剂、与溶质形成离子对，或作为毛细管内壁的改性剂等，以改善分离效率。常用表面活性剂有：阴离子—十二烷基硫酸钠（SDS）阳离子---十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）两性离子---N,N’二甲基胺-3-丙烷-1-磺酸82表面活性剂在毛细管电泳中常添加表面活性剂，作为疏水性溶质的增手性选择剂在操作缓冲液中加入少量手性试剂可以实现手性分离。常用的手性试剂有：环糊精、冠醚、胆汁盐等选择手性试剂的种类、浓度或添加醇类、表面活性剂、金属离子等可提高选择性 83手性选择剂在操作缓冲液中加入少量手性试剂可以实现手性分离。常温度与毛细管内壁改性温度——恒温是消除焦耳热的主要目的，但温度也可作为一个优化分离的参数。通过调节温度来改变溶液黏度、EOF和分析时间，以达到分离目的毛细管内壁改性——在分离生物大分子物质如蛋白质时，由于它们可被毛细管内壁强烈吸附,使分离效率大大降低。需对毛细管内壁改性：永久性改性——硅烷化动力学去活——操作缓冲液中加改性剂84温度与毛细管内壁改性温度——恒温是消除焦耳热的主要目的，但温例氯苄律定对映体在家兔体内药代动力学研究电泳条件：羧甲基环糊精衍生物(CM--CD)为手性拆分剂,最佳浓度5mmol/L毛细管柱48cm58m75mmol/L磷酸盐缓冲液（pH2.3）UV检测波长200nm电迁移进样(20kV16s)电压20kV,柱温20C85例氯苄律定对映体在家兔体内药代动力学研究电泳条件：25讨论：用酸性缓冲液体系，有效控制了毛细管内电渗流电迁移进样可以消除血浆中酸性或中性内源性物质的干扰，使被测物有选择地进样采用柱上场放大堆积浓集样品，在进样前先在毛细管进样口引入一个短的稀缓冲液水柱，因样品离子的电泳速度与电场强度成正比，故使样品塞中离子堆积在高浓度缓冲液界面上从结构看，本品手性碳藏于四环体系中，用一般的CD难以分离两对映体，衍生酸性羧甲基后可与药物的碱性基团发生静电吸引，有利于手性识别86讨论：用酸性缓冲液体系，有效控制了毛细管内电渗流26胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）MECC是电泳技术与色谱技术的交叉，也是唯一既能分离中性物质又能分离带电组分的电泳技术。把表面活性剂加到缓冲液中，在表面活性剂的临界浓度以上，单个表面活性剂之间聚集形成胶束。疏水性一端聚在一起朝向里，带电荷的一端则朝向缓冲液87胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）MECC是电泳技术与MECC的作用原理表面活性剂分子和胶束通常是带电的，以与EOF相同或相反的方向移动，但EOF的移动速度一般较胶束快

88MECC的作用原理表面活性剂分子和胶束通常是带电的，以与EO选择性与分离度通过选择不同的表面活性剂，改变缓冲液浓度、pH值和操作温度，使用添加剂（尿素、金属离子、手性试剂），加入有机修饰剂（甲醇、乙腈、异丙醇）等来控制溶质与胶束之间的相互作用，以提高色谱的选择性在分离中性物质时，所有溶质都在t0与tm之间流出。亲水性溶质随EOF流出，被胶束完全保留的溶质随胶束流出。控制条件，采用中等程度的EOF和高迁移率的胶束，以扩大时间窗口，提高分离度89选择性与分离度通过选择不同的表面活性剂，改变缓冲液浓度、pH时间窗口

t0

tR1tR2tR3

tm胶束EOF

t0

tm溶质中性溶质的流出时间窗口示意图90时间窗口t0tR1例1兔血浆中氟比洛芬的测定电泳条件：75m100cm毛细管柱分离电压30kV,温度30C°虹吸进样30sUV检测波长254nm分离缓冲液为20mmol/L硼砂含25mmol/LSDS,pH9.02讨论:硼砂缓冲液中加入SDS可包裹血浆中蛋白质，减少蛋白质对分离测定的干扰和对柱的污染空白血浆血样内标91例1兔血浆中氟比洛芬的测定电泳条件：空白血浆血样内标31例2高效毛细管电泳法测定注射用水溶性维生素的含量

采用胶束电动毛细管色谱法，分离分析注射用水溶性维生素制剂中VB1、VB12、VB6、VC、烟酰氨、叶酸、D-生物素、核黄素磷酸钠、泛酸钠9种成分电泳条件：未涂层熔融石英毛细管(67cm×50m，有效长度55cm)运行缓冲液为50mmol/LSDS-50mmol/L的硼酸钠（pH8.33）检测波长214nm压力进样（6.89KPa×10s）运行电压15.0kV；毛细管柱温25℃92例2高效毛细管电泳法测定注射用水溶性维生素的含量采用胶束分析前毛细管处理每天分析之前，分别依次用1mol/L氢氧化钠溶液、高纯水、运行缓冲液冲洗5,10,10min每次分析之间分别用0.1mol/L氢氧化钠溶液、高纯水、运行缓冲液冲洗毛细管3,5,5min93分析前毛细管处理每天分析之前，分别依次用1mol/L氢氧化测定方法取约1.5g的内容物，精密称定，置于10ml量瓶中，用水冲洗瓶内壁，洗液与样品合并，加水溶解并稀释至刻度，混匀。用0.22m微孔滤膜过滤后，在上述电泳条件下进样，记录维生素B12和D-生物素的峰面积另精密量取上述样品溶液1.0ml,置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，同法测定，记录VB1,VB6,VC、烟酰氨、叶酸、核黄素磷酸钠、泛酸钠的峰面积，按外标法计算样品含量94测定方法取约1.5g的内容物，精密称定，置于10ml量瓶中，测定结果测得各种成分按标示量计算的百分含量（%）在97.5±0.9到103.8±0.7之间（n=3）制剂中9种成分的毛细管电泳图如下：1-烟酰氨；2-VB6；3-D-生物素；4-核黄素磷酸钠；5-VB12；6-VC；7-泛酸钠；8-叶酸；9-VB1混合对照液制剂95测定结果测得各种成分按标示量计算的百分含量（%）在97.5±毛细管电色谱（CEC）将HPLC中的固定相填充到毛细管中作为固定相，以电渗流为流动相的驱动力，利用样品与固定相的相互作用的差异而达到分离HV分离柱检测器分流控制阀反压阀高压电源电极96毛细管电色谱（CEC）将HPLC中的固定相填充到毛细管中作为例氟西汀和西替利嗪对映体的双动态吸附毛细管电色谱手性分离以SO3--CD为手性选择剂，海美溴铵(HDB)为阳离子表面活性剂，在Tris-H3PO4(pH3.0)的体系中分离了氟西汀和西替利嗪对映体色谱条件毛细管柱35cm50m,有效长度30cm压力进样：13.8kPa4s；分离电压15kV紫外检测210nm；分离柱温25C97例氟西汀和西替利嗪对映体的双动态吸附毛细管电色谱手性分离以讨论采用HDB作添加剂使形成双动态涂层，反转电渗流，采用正极检测，大大缩短分析时间在20mmol/LTris-H3PO4(pH3.0)条件下，HDB含量0.1g/L，SO3--CD20mmol/L，氟西汀和西替利嗪对映体在较短的时间内达到良好分离pH2时石英毛细管壁的硅羟基不解离，即使加入HBD也无法形成双动态吸附。当pH增加到3时，硅羟基发生解离后而带负电，带正电的HBD通过静电作用在柱内形成第一动态涂层，而后再静电吸附一层负电性的SO3--CD，双动态吸附的形成导致分析物R值的增大98讨论采用HDB作添加剂使形成双动态涂层，反转电渗流，采用正极例梯度加压毛细管电色谱同时分离大黄提取液中5种蒽醌类化合物毛细管电色谱主要是以电驱动流动相为主要的分离模式，而压力流驱动毛细管电色谱是以液相色谱泵为流动相的主要驱动力，它克服了仅靠电渗流驱动的一些限制因素，可方便地对流动相的组成、性质和流速进行调节，尤其是能够实现流动相梯度洗脱，是毛细管电色谱法发展的重要方向99例梯度加压毛细管电色谱同时分离大黄提取液中5种蒽醌类化合物色谱条件C18熔硅毛细管柱（27cm75m），有效长度20cm流动相A组成：醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=4.5)；流动相B组成：乙腈流动相流速0.08mL/min进样阀定量进样20nL在260nmUV柱上检测-3kV电压下，大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸5种成分得到最好分离效果100色谱条件C18熔硅毛细管柱（27cm75m），有效长度AE为5种梯度（不加电压）在上述C梯度条件下，改变电压最佳分离结果101AE为5种梯度在上述C梯度条件下，改变电压最佳分离结果41多种色谱技术提供了不同的选择性102多种色谱技术提供了不同的选择性42四、毛细管电泳仪装置示意图103四、毛细管电泳仪装置示意图43进样进样体积一般是不知道的，进样量通常用压力与时间或电压与时间表示。（注意：样品区带的长度应不超过毛细管总长度的1%-2%）。方法有：流体力学方式在进样端加气压在出口端抽真空利用虹吸现象104进样进样体积一般是不知道的，进样量通常用压力与时间或电压与时虹吸抽真空流体动力加压气动进样示意图105虹吸抽真空流体动力加压气动进样示意图45电动进样用样品管替换缓冲液管，施加电压来完成进样。这种进样方式的进样量取决于组分的电泳淌度，对于离子型组分有进样歧视，迁移速度快的离子比迁移速度慢的离子进去得要多一些。106电动进样用样品管替换缓冲液管，施加电压来完成进样。这种进样方毛细管熔融石英毛细管有效长度为50～75cm，总长度一般比有效长度多5～15cm，内径为20～75m。毛细管使用前后需用碱液、缓冲液冲洗毛细管温度的控制对于操作重现性很重要，常采用液体恒温或空气恒温方式，前者比较有效，后者仪器装置简单、操作方便毛细管电泳所用高压电源要能提供30kV的直流电压和200～300A的电流。最好使用双极性电源，能进行极性切换107毛细管熔融石英毛细管有效长度为50～75cm，总长度一般比有泡状池示意图光源检测器毛细管电泳的检测方式是采用柱上检测，透光窗直接开在毛细管上，不存在死体积和组分混合而产生谱带展宽现象108泡状池示意图光源检测器毛细管电泳的检测方式是采用柱上检测，透五、毛细管电泳与其它技术联用毛细管电泳与其它技术联用拓宽了毛细管电泳的应用范围。例不同电泳技术间的联用（等速电泳与区带电泳联用，CITP-CZE）高效液相与毛细管电泳联用（HPLC-HPCE）毛细管电泳与质谱联用免疫分析与毛细管电泳联用——毛细管电泳免疫分析。利用抗原抗体复合物与游离抗原、抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为免疫分析的检测手段109五、毛细管电泳与其它技术联用毛细管电泳与其它技术联用拓宽了毛例1：毛细管液相/毛细管电泳二维系统小承气汤uHPLC:EP-250-80-5-C18(A)CH3OH;(B)H2OMEKC:36cmx75um30mMSDS,8mMNaBr,5mMK2HPO421kv210nm110例1：毛细管液相/毛细管电泳二维系统小承气汤50例2：二维毛细管电泳电化学检测尿样中的-阻断剂设计制作了在柱电化学(EC)检测池，用于在同一根毛细管中进行中心切割二维毛细管电泳(2D-CE)在线纯化分离检测尿