药品热原课件

《中国药典》2005年版生物检定二00五年六月一、什么是热原？在临床上使用注射剂时，常易发生不良反应，有时可极为凶险。病人在静脉注射药剂后约15分钟可能发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、腰痛、关节痛、肤色灰白、昏迷、休克。这些症状使病人感到很大不适，或者加重病情，甚至也增加病人死亡的机会。尤其是在人类初期静脉注射药剂时，对如何控制这一症侯群的发生，甚感困惑。1875年Burdon-Sanderson从腐肉中分出不带活菌的物质，能引起上述一系列症状，并称之为热原（Pyrogen），而称上述一系列不良反应为热原反应。药品热原三、家兔热原检查法优缺点：家兔热原检查法的优点是：它能反映热原引起哺乳动物复杂的升温反映过程。热原检查法自1942年实施以来，基本上解决了注射药品引起热原反应问题，这是一个定性实验，因此，热原检查法的缺点就是不能定量。不能定量的原因如下：1、热原的绝对不均一性（不同细菌来源的不一致性），不知道被检测样品中存在的热原到底是哪一种，因此无法确定选择从哪一种细菌制备的热原作为一个“标准品”。2、家兔经常处于被革兰氏细菌污染的环境中，通过吸入、食入、皮肤，感染了这些细菌，可以说每个家兔在生活中或多或少地被革兰氏细菌免疫了。3、热原检查法的灵敏度比较差，主要原因是动物个体之间对热原反应性的差异，特别是边缘产品。4、药品本身的药理活性干扰家兔体温。四、热原致热机理和本质多年来的研究已经证明，热原进入人体血液循环系统后，并不直接引起发热和其它毒性反应，但它可使白细胞（单核细胞）释放“内源性热原”，目前认为后者是具有热原和炎症活性的细胞变动素（Cytokines）混合物。它们包括：白细胞介素-1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6和干扰素。这种内源性热原可直接作用于中枢神经系统（脑干细胞核）刺激体温中枢，使机体发热。什么是热原？目前国内外仍未统一认识，但从国内外文献有关热原本质、热原结构的报道中，都一致认为它是细菌内毒素（脂多糖）。药品中经常遇到的热原是细菌内毒素。一般可以接受的观点是，不存在内毒素意味着不存在热原。热原的本质，仍然是一个有争议的问题，笔者认为：热原很可能是一类能刺激哺乳动物体内产生细胞变动素（Cytokines）的物质的总称。五、热原试验的研究进展1990年美国药典委员会、美国药品管理局生物评价和研究中心制品质量检定处，组织了12个实验室进行了一次协助研究，其目的是：⑴确定家兔热原试验测定最高升温的合适的间隔时间。⑵确定家兔体重对不同剂量内毒素（参考标准品和工作标准品）升温反应的影响。⑶确定美国药典提出的家兔经注射含有热原质的样品，休息2周后，再重复使用是否合适。⑷确定最高升温0.6℃的限度，是否需要修改。⑸比较内毒素参考标准品和内毒素工作标准品。协作研究的结果和结论是：⑴由于观察到最高体温的平均时间在1.5～2.0小时之间，因此对美国药典热原试验的一个重要建议是：在注射药品后1～3小时之间，每30分钟记录一次家兔体温。⑵家兔体重不影响内毒素剂量对体温的反应，故建议按家兔每公斤体重计算给药剂量。（在此之前，美国药典论坛曾提出，按人体每公斤体重计算给药剂量）⑶建议美国药典应重新评价家兔接受了热原制品后休息14天重复使用的规定，应增加休息时间或不允许重复使用。⑷建议美国药典根据人体的致热阈值5.0EU/kg将体温升高由0.6℃降至0.5℃。一、家兔热原检查法用具1、天平2、电热干燥箱（0～300℃）3、恒温水浴：超级水浴4、温度计，精度0.1℃5、家兔固定盒6、实验用具7、试剂录选新兔编号、登记入兔史记录卡，未被录选家兔，可饲养7日再予测体温1次，如仍不符合要求则淘汰。家兔的重复使用供试品判定为符合规定的家兔，至少休息2日，方可供下一次实验用。供试品判定为需要重复实验的家兔，应暂作休息处理，如重复合格，升温≥0.6℃的家兔，应重新测温挑选。供试品判定为不符合规定的家兔，不再使用。每一家兔的使用次数，最多为10次，体重逐渐减轻或超过3.0kg的家兔，不再使用。复试用家兔挑选体重在2.0～2.4kg、正常体温在38.8～39.2℃、使用过2～3次的家兔进行实验。实验用家兔必须从有合格证的单位购买。四、检查法1、选符合规定的家兔，停止给饲料和水，称重后置于家兔固定盒内至少1小时。2、每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温不得超过0.2℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。3、当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃范围内，且各兔间相差不得超过1℃。4、每个供试样品用家兔3只，在测定正常体温后15分钟内给药。5、供试品的剂量，应按各该药项下的规定注射，未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人按50kg计），用临床一次剂量的3～10倍。6、供试品注射的体积，按家兔体重每kg不小于1ml，不大于10ml。体积在5～10ml/kg的溶液应在37～38℃预热后注射。7、供试品配制完毕后，应在30分钟内注射于家兔体内。8、需缓慢注射的药液，注射时间（除另有规定外）一般每兔不超过5分钟。9、给药后每隔30分钟测量体温一次，共6次。五、结果判断1、判断复试初试3只家兔中仅有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔升温均低于0.6℃，但升温的总数达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试。含有热原的供试品，一般在给家兔静脉注射后1～2小时出现升温高峰，当第3小时升温≥0.6℃时，宜复试后再作判断。2、判断合格初试3只家兔中，体温升高均在0.6℃以下，并且3只家兔升温的总数在1.4℃以下可判断为符合规定。复试5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔数不超过1只，并且初复试合并，8只家兔的升温总数为3.5℃或3.5℃以下，可判断为符合规定。当家兔升温为负值时,均以0℃计.3、判断不合格初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔数超过1只，可判断为不符合规定。复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只，可判断为不符合规定。初复试合并8只家兔的升温总数超过3.5℃，可判断为不符合规定。异常毒性检查法标准操作规范供试用的小鼠应健康合格，体重17-20g，在试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。作过本试验的小鼠不得重复使用。供试品溶液的配制除另有规定外，用氯化钠注射液按各药品项下规定的浓度制成供试品溶液。检查法除另有规定外，取上述小鼠5只，按各药品项下规定的给药途经，每只小鼠分别给予供试品溶液0.5ml，给药途径分为以下几种：静脉注射将供试品溶液注入小鼠尾静脉，应在4～5秒匀速注射完毕。腹腔注射将供试品溶液注入小鼠腹腔。皮下注射将供试品溶液注入小鼠腹部或两侧皮下。口服给药

将供试品溶液通过适宜的导管，灌入小鼠胃中。结果判断除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重18～19g的小鼠10只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。附：注射液中不溶性微粒检查法标准操作规范本法（中国药典2000年版二部附录IXC）适用于澄明度检查符合规定后，用以检查静脉滴注用注液（装量为100ml或100ml以上者）中的不溶性微粒。药典规定了两种检查方法。一、显微计数法除另有规定外，每1ml中含有10μm以上的微粒不得过20粒，含25μm以上的微粒不得过2粒。材料和用具具高效微粒吸着装置的层流净化台、显微镜、微孔滤膜及其滤器。微孔滤膜为白色，孔径0.45μm，直径25mm，并具有格栅；膜上如有10μm以上的不溶性微粒，应在5粒以下，并不得有25μm以上的微粒，必要时，可用净化水冲洗使符合要求。本法所用净化水，每100ml中含10μm以上的不溶性微粒应在10粒以下，使用前应经0.45μm微孔滤膜滤过。检查法：取样25ml，取样前翻转20次，显微镜放大100倍，分别检测有效过滤面积上最长直径大于10μm的微粒数，以及大于25μm的微粒数，即得。二、光阻法：仪器：激光微粒测定仪，每6个月校正一次。实验环境及检测实验所处环境应不能导入明显的微粒，玻璃仪器和其他所需用品都应洁净。本法所用纯化水应使用不大于1.2μm的滤膜滤过。检查法：翻转20次，每次取样量不少于5ml。开始仪器缓慢搅拌使溶液均匀，依法测定不少于3次：第一次测得数据弃去，取稳定后两次测定结果的平均值，即得。注意事项：1、光阻法不适于测定混悬液、乳剂、胶体溶液、脂肪乳及易析出结晶的制剂，如甘露醇注射液等。2、结果与判断同第一法。一、细菌在自然界，细菌属微生物中原核生物，根据细菌对革兰氏染色法的反应，可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，这种区别主要是细胞壁的结构性质有关。二、细菌毒素细菌毒素可归纳为两类，一类称外毒素（Exoiaxin），它是细菌的代谢产物，大多数革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌在生长繁殖的过程中，经常不断地向菌体外分泌这些毒素，一旦细菌死亡、解体，毒素也不再产生。另一类称内毒素（Endotoxin），它是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁上的特有结构，革兰氏阳性菌则无，它在细菌生长、繁殖过程中，并不分泌到介质中，也不能从外壁层上自然脱落，不是细菌的代谢产物，当细菌死亡、解体后，方显示出一系列的内毒素生物活性。三、结构与化学成分内毒素的化学结构是脂多糖（LipopotysaccharideLPS）和蛋白（Protein）的复合物，脂多糖由三部分组成：1、特性链又称特异多糖链；2、核心多糖；3、类脂A内毒素的物质活性主要在这部分。游离的类脂A，可自身凝聚成高分子的复合体，其分子量大小不等。游离的类脂A含有疏水性的中心及亲水性的边沿，是一种双相分子，又是酸碱两性分子，类脂A的独特结构是内毒素具有多种生物活性之所在。五、名词解释细菌内毒素国家标准系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价（NSE）。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU（WSE）。细菌内毒素检查用水系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水（BET水）。六、供试品细菌内毒素限值的计算：根据公式L＝K／M式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/hr表示。注射剂，K=5EU/kg/hr，其中放射性药品注射剂K=2.5EU/kg/hr，鞘内用药品，K=0.02EU/kg/hr。M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/kg/hr、mg/kg/hr、U/kg/hr表示，中国人按人均体重60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计。注：大输液品种M=10ml/kg/hr2、林可霉注射液L=0.5EU/mg,C=600mg/2ml当用灵敏度为0.25EU/ml鲎试剂时,MVD=300mg/ml×0.5EU/mg0.25EU/ml=600倍3、注射用青霉素钠：规格80万单位/瓶，用4mlN.S复溶，即为C=20万u/mlL=0.01EU/1000u当用灵敏度为0.25EU/ml鲎试剂时,MVD=20万u/ml×0.01EU/1000u0.25EU/ml=8倍八、鲎试剂灵敏度复核设待复核的鲎试剂的标示灵敏度为0.125EU/ml内毒素浓度EU/ml0.250.1250.06250.3125N反应终点浓度重1复2管3数4++---0.125+----0.25+++-□0.0625++--□0.125λ=1g–1(∑Xs/4)=1g–1［(1g0.125+1g0.25+1g0.0625+1g0.125)/4］=0.125(EU/ml)λs有0.5λ～2.0λ范围内，符合规定，九、干扰试验设所用鲎试剂的标示灵敏度为0.125EU/ml,供试品为××注射液(1→4).内毒素浓度EU/ml0.250.1250.06250.03125N反应终点浓度1+++--0.06252内毒素标准溶液+++--0.06253+++-□0.06254+++-□0.06251