能源植物续随子延伸因子EF1A基因cDNA序列的克隆及分析

能源植物续随子延伸因子EF1A基因cDNA序列的克隆及分姚正颖;张丹;李春霞;侯北伟;张卫明;孙力军【摘要】利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到能源植物续随子延伸因子EFIA基因的cDNA序列(命名为ElEF1A,GenBank登录号为KT892703).序列分析表明归EF1A编码序列(CDS)长1344bp,编码447个氨基酸，氨基酸序列具有典型的EF1-alpha、EF1-alpha-H和EF1-alpha-B结构域.E1EF1A与其他植物EF1A基因的核苷酸序列同源性达到88%以上，推导的氨基酸序列的同源性达95%以上.【期刊名称】《中国野生植物资源》【年(卷)，期】2016(035)001【总页数】7页(P6-11,27)【关键词】续随子;EF1A基因;内参基因;RACE【作者】姚正颖;张丹;李春霞;侯北伟;张卫明;孙力军【作者单位】南京野生植物综合利用研究院,江苏南京210042;南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023;南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042;南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042;南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042【正文语种】中文【中图分类】Q785真核生物蛋白质生物合成的翻译延伸阶段需要几个可溶性蛋白的参与，这些蛋白称作真核生物延伸因子(eEF)，包括eEF1和eEF2。eEF1由4个亚基构成，分别为eEF1A、eEF1Ba、eEF1BB和eEFlBy，发挥介导氨酰-tRNA与核糖体结合的作用［1］。eEF1A在生物体细胞内大量存在，含量占正常细胞总蛋白的1%~3%，仅次于肌动蛋白Actin［2］。eEF1A是G蛋白家族一员，在蛋白质翻译延伸过程中的发挥鸟苷三磷酸酶(GTPase)的作用。即eEF1A首先与GTP结合成二元复合物，运送氨酰-tRNA进入核糖体的氨酰位(A位)。一旦与mRNA形成正确的密码子-反密码子对，GTP立即水解成GDP,eEF1A-GDP二元复合物就与氨酰-tRNA解离而释放［1］。eEF1A除了参与蛋白质翻译外，还有许多重要功能，如参与蛋白降解、细胞生长与增殖、信号传导、翻译控制、细胞骨架组成、细胞凋亡等［3-4］。eEF1A在真核生物体中所发挥的诸多重要功能说明了该蛋白是高度保守的。续随子(EuphorbialathyrisLinn.)属于大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(EuphorbiaLinn.)，是一种极具开发价值的能源植物。研究表明续随子种子含油量高达43.3%~47.0%［5-6］，油中脂肪酸成分以C16、C18脂肪酸为主，且油酸(只含1个不饱和双键)含量可高达84.42%［7］,与理想柴油替代品的分子组成相类似，是生产生物柴油的优良原料［8］。此外，续随子乳汁管能分泌白色乳汁，其中富含与石油成分类似的碳氢化合物，经分离提取和处理，可制成石油化工产品［9］。作为一种甜土植物，续随子还具有一定耐盐和耐旱性［10-11］，适宜在沿海滩涂或干旱少雨沙化地区发展种植。因此续随子是兼具能源收益和生态效益的新型能源油料作物。目前对于续随子抗性和脂肪酸代谢相关的分子生物学研究已成为研究续随子的新方向。实时定量PCR是深入分析相关功能基因表达和调控的重要手段，因此需要选择合适的内参基因进行校正和标准化。传统持家基因如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、肌动蛋白基因(Actin)、EF1A基因以组成型稳定表达而常被选作内参基因［12］。目前已有许多植物EF1A基因被成功分离，如玉米［13］、棉花［14］、拟南芥［15］、木薯［16］、橡胶［17］、油桐［18］等，然而关于续随子EF1A基因的研究尚未见文献报道。本研究利用同源克隆和RACE技术克隆了续随子EF1A基因cDNA序列，以期为续随子分子生物学研究奠定基础。1.1材料续随子种子为南京野生植物综合利用研究院保存的高油品种。选取成熟种子100粒，用稀释1000倍的多抗霉素加吐温80浸泡4h，自来水冲洗5~6次，种在Hoagland营养液浸透的蛭石中，置于25°C温室，12h光照/12h黑暗交替培养。20d后采集续随子幼苗，液氮速冻，-80C保存待用。大肠杆菌DH5a为本实验室保存。1.2方法1.2.1总RNA提取采用Beyozol总RNA抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所)提取续随子幼苗叶片的总RNA,-80C保存待用。利用核酸蛋白检测仪和甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量。1.2.2cDNA反转录合成cDNA合成按照M-MLV反转录酶(大连宝生物工程有限公司)的操作说明进行。合成用于扩增中间片段和3'-RACE的cDNA使用弓物3'-CDS:5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN-3'(V=A/G/C,N=A/G/C/T);合成用于扩增5'-RACE的cDNA使用弓物EF1A5'GSP2:5-TGGGAGTAGTGGCATCCATCTTGTT-3',将所得cDNA纯化，并利用末端脱氧核糖核酸转移酶(大连宝生物工程有限公司)在cDNA的5'端加Poly(C)尾。1.2.3续随子EF1A基因中间片段的克隆通过比对已发表的大戟科植物及其他植物EF1A基因的核苷酸序列，根据序列的同源性设计一对引物，用于扩增EF1A基因中间片段。EF1A-up:5'-CACACTAACATHGTNGTCATT-3';EF1A-dowm:5'-ACNACCATGGGCTTGGTNGG-3，。扩增程序：94C3min;94^50s,55^50s,72C1min,30个循环；72C10min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。得到与预期大小相符的条带后，用生工生物工程公司的SanPrep柱式胶回收试剂盒进行回收纯化，将目的片段与PMD19-T载体体系连接，转化大肠杆菌DH5a感受态，经菌落PCR验证正确后，转至含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养，菌液送上海美吉生物医药有限公司测序。1.2.4续随子EF1A基因3'-RACE和5'-RACE的克隆根据已获得的续随子EF1A基因中间片段，设计3'-RACE扩增引物：EF1A-3'GSP1(5'-TGGATTGCCACACCTCCCACATAGC-3')和Short(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3');设计5'-RACE扩增引物：EF1A5,GSP1(5,-TGAGGACAGCACAGTCAGCCTGCGA-3,)和OligodG1(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTSC(G)12HN-3')°3'-RACE和5'-RACE的扩增采用降落PCR，反应条件均为：94C30s,72C2min,5个循环；94C30s,70C30s,72C2min,5个循环；94C30s,68C30s,72C2min,25个循环。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物经回收、连接、转化及测序得到目的片段。1.2.5续随子EF1A基因CDS全长的获得将测序正确的中间片段及其3'端、5'端序列通过VectorNTIAdvance11软件拼接并获得EFIA基因开放式阅读框(ORF)。根据ORF设计一对特异性引物EF1A-S和EF1A-A，扩增获得续随子EF1A基因CDS全长。EF1A-S：5'-ATGGGTAAGGAGAAGGTTCACATC-3';EF1A-A：5'-AAGTCTGCAGCCAAGAAGAAATGA-3'。1.2.6续随子EF1A基因序列分析利用VectorNTIAdvancell软件分析续随子EF1A基因ORF、推导氨基酸序列。利用NCBI网站在线BLAST程序对测定序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。利用NCBI网站在线保守区数据库(CCD)分析预测氨基酸序列的结构域。利用MAGA4.1软件对预测氨基酸序列进行进化树分析。2.1续随子叶片总RNA样品的质量检测续随子叶片总RNA的甲醛变性胶电泳结果如图1所示，28SrRNA、18SrRNA条带清晰，无拖尾现象，说明该试验提取的RNA完整性较好。利用核酸蛋白检测仪测定RNA的纯度，A260/A280为1.9左右，表明续随子叶片总RNA提取质量高，可用于后续的分子生物学分析。2.2续随子EF1A基因CDS序列的获得通过同源克隆获得EF1A基因cDNA中间片段，大小约为1100bp。经测序和BLAST比对验证正确后，基于该片段设计特异弓物扩增3'-RACE和5'-RACE，大小分别为650bp左右和500bp左右(图2)。采用VectorNTIAdvance11软件对所有片段进行拼接，结合BLAST比对和分析，找到续随子EF1A基因的ORF。基于该ORF设计引物进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在约1300bp处可见明显条带(图2),与预期大小相符，测序结果与拼接结果一致。续随子EF1A基因的CDS序列全长1344bp，编码447个氨基酸。将该基因cDNA命名为EIEF1A,GenBank登录号为KT892703。完整的EIEF1A基因cDNA序列和编码蛋白的氨基酸序列如图3所示，经NCBI网站在线保守区数据库(CCD)分析，该蛋白氨基酸序列具有典型的EF1-aIpha、EF1-alpha-H和EF1-aIpha-B结构域。2.3续随子EF1A基因序列同源性及系统进化分析将续随子EF1A基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列提交至NCBI进行在线BLAST分析，结果表明，E1EF1A与蓖麻、油桐、水稻、玉米、葡萄、蔷薇、大麦、番茄、含羞草等植物的EF1A基因高度同源，如与同属大戟科蓖麻和油桐的相似性达到90%，与陆地棉、碧桃的相似性达到88%。ElEF1A基因编码的氨基酸序列与同科植物蓖麻、麻疯树以及不同科植物葡萄、巨桉的相似性高达99%。选取相似性较高的8种植物EF1A氨基酸序列进行多序列比较分析，结果显示，不同植物的EF1A氨基酸序列相当保守，序列相似性均在95%以上，最高达到99%，仅在少数位置有差异（图4）。利用MAGA4.1软件，选择相邻连接法（neighborjoining，NJ）绘制进化树。结果如图5所示，续随子EF1A基因推测的氨基酸序列与同属大戟科植物蓖麻子RcEF1A氨基酸同源性最高且聚为一支，说明二者亲缘关系最近；与碧桃PpEF1A氨基酸同源性次之；而与物种同源性最低的拟南芥相比，氨基酸序列同源性也高达96%，进一步证明了EF1A是一种高度保守的基因，在物种进化过程中可能执行相近的功能。通过上述生物信息学分析结果，可以初步确定本试验所克隆的CDS为续随子延伸因子基因，且具有高度保守性，有可能成为研究续随子其他功能基因的内参基因。EF1A氨基酸来源和GeneBank登录号：AtEF1A（拟南芥，CAA34456）；StEF1A（马铃薯，ABB86283）；RmEF1A（蔷薇，AEQ75495）；ZjEF1A（枣树，AEN79476）；PpEF1A（碧桃，EMJ19204）；RcEF1A（蓖麻，XP_002528028）；GmEF1A（大豆，XP_003553293）；GhEF1A（陆地棉，ABA12218）；ElEF1A（续随子，unassigned）由于能源植物续随子的分子生物学研究尚未全面开展，为了研究续随子抗性和脂肪酸代谢相关功能基因的表达和调控，需要克隆一些组成型稳定表达的基因作为候选内参基因。本课题组前期已通过同源克隆技术和RACE技术获得了续随子的肌动蛋白基因（Actin）作为候选内参［19］，本研究采用相同的方法克隆了续随子的EF1A基因。根据已知大戟科植物及其他植物EF1A基因的核苷酸保守区设计简并引物，扩增获得了续随子EF1A基因的中间片段。对于EF1A基因的5’和3'端序列的扩增，本研究采用了改良的RACE技术。首先在合成cDNA第一条链时，在oligod(T)引物的3'端引入两个简并的核苷酸V、N(V=A/G/C,N=A/G/C/T),使引物锚定在Poly(A)尾的起始点，减小oligod(T)与Poly(A)尾的其他部位结合的机率，从而增大了扩增效率。另外，在5'端加尾时，利用Poly(C)引物代替常用的Poly(A)，同时采用降落PCR，提高了退火温度，进一步增大了特异性条带的扩增效率。利用改良RACE技术扩增未知基因不仅高效而且节省费用，将为其他真核生物的基因克隆提供参考。本研究获得的续随子EF1A基因cDNA的CDS全长1344bp，编码447个氨基鼠经BLAST比对分析，植物EF1A蛋白高度保守，表明EF1A基因可能在物种进化过程中执行相近的功能。将本研究获得的EF1A基因与NCBI的GenBank数据库中已登录的1条续随子EF1A基因(登录号JQ694163.1)进行比对发现，二者CDS长度相同，核苷酸相似度为94%、推测的蛋白氨基酸相似度为98%，表明续随子的EF1A可能由至少2个基因编码。研究证实，植物的EF1A大多由多基因编码，如大豆和胡萝卜EF1A由2个基因编码、拟南芥和水稻的EF1A由4个基因编码、棉花的EF1A由9个基因编码、玉米的EF1A由10个以上基因编码［13-14,20］。这种现象可能保证了植物在各种逆境条件下蛋白质翻译的真实性。对已克隆的植物EF1A基因研究表明，EF1A的表达受激素、环境胁迫和生育过程等因素诱导，进而调控蛋白质合成，以适应各种环境条件和植物生长发育阶段的需要。此外EF1A还是一种组织特异性表达蛋白［3］。因此，以EF1A作为研究续随子抗性和脂肪酸代谢相关功能基因表达和调控的候选内参基因，其在不同处理条件下以及不同组织部位中的表达稳定性还需进一步深入研究。本研究克隆得到续随子EF1A的cDNA序列(ElEF1A),CDS全长1344bp，编码447个氨基酸，氨基酸序列具有典型的EF1-alpha、EF1-alpha-H和EF1-alpha-m结构域。ElEF1A与其他植物EF1A基因的核苷酸序列同源性达到88%以上，推导的氨基酸序列同源性达95%以上。【相关文献】SASIKUMARAN,PEREZWB,KINZYTG.Themanyrolesoftheeukaryoticelongationfactor1complex[J].WileyInterdisciplinaryReviews:RNA,2012,3(4):543-555.INFANTEC,ASENSIOE,CAAVATEJP,etal.Molecularcharacterizationandexpressionanalysisoffivedifferentelongationfactor1alphagenesintheflatfishSenegalesesole(SoleasenegalensisKaup):Differentialgeneexpressionandthyroidhormonesdependenceduringmetamorphosis[J].BMCMolecularBiology,2008,9(1):19.覃迎姿,黄先益,叶兴枝，等.植物延伸因子eEF1A研究进展[J].广西农业科学，2009,40(5):472-477.陈燕,王伟倩，张红莉,等.拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究[J].河南师范大学学报(自然科学版),2015,1:106-109.程莉君,钱学射，顾龚平,等.能源作物续随子的综合利用和栽培[J].中国野生植物资源,2007,26(4):19-22.张卫明,史劲松,顾龚平.生物质能的利用和能源植物的开发[J].南京师大学报(自然科学版)，2007,30(3):68-74.王亚辉,李招娣，邓红，等.续随子冷榨油脂肪酸及蛋白质氨基酸组成分析[J].中国粮油学报，2009,11:74-77.WANGR,HANNAMA,ZHOUWW,etal.Productionandselectedfuelpropertiesofbiodieselfrompromisingnon-edibleoils:EuphorbialathyrisL.,SapiumsebiferumL.andJatrophacurcasL・[J].BioresourceTechnology,2011,102(2):1194-1199.刘冲,王茂文,丁海荣,等.NaCl胁迫对续随子光合作用及叶绿素荧光特性的影响[J].西南农业学报,2012,25(5):1642-1646.岳丽娜，邱苗苗，苏晓瑜，等.盐碱地野生能源植物筛选初探[J].河南农业科学,2007,6:40-42.YANGJ,CAOY,YANGZY,etal.Morphological,physiologicalandbiochemicalresponsesofbiofuelplantEuphorbialathyristosaltstress[J].ActaAgriculturaeScandinavica,SectionB-Soil&PlantScience,2013,63(4):330-340.胡瑞波,范成明,傅永福.植物实时荧光定量PCR内参基因的选择[J].中国农业科技导报，2009,11(6):30-36.CARNEIRONP,HUGHESPA,LARKINSBA.TheeEFlAgenefamilyisdifferentiallyexpressedinmaizeendosperm[J].PlantMolecularBiology,1999,41(6):801-814.XUWL,WANGXL,WANGH,etal.MolecularcharacterizationandexpressionanalysisofninecottonGhEF1Agenesencodingtranslationelongationfactor1A[J