研究噬菌体Bp4和Bp7对不同大肠杆菌宿主菌的感染效率

青岛农业大学毕业论文题目：噬菌体Bp4和Bp7在不同宿主菌中的增殖殖效率分析姓名：学院：动物科技专业专业：动物医学专业班级：学号：指导教师：2015年6月03日目录摘要 1Abstract 1引言 11材料与方法 21.1材料 21.1.1 菌株与噬菌体 21.1.2培养基 21.1.3主要仪器设备与器材31.2方法31.2.1宿主菌的复苏与增殖 31.2.2噬菌体的复壮与增殖 31.2.4噬菌体与菌液的相互作用 42结果与分析 43讨论 6致谢 9参考文献 10④组份Bp4+23Bp4+25Bp7+23Bp7+39结果与分析将分别在25号宿主菌和23号宿主菌增殖的噬菌体Bp4和在分别在39号宿主菌和23号宿主菌增殖的噬菌体Bp7，与23号宿主菌、25号宿主菌、39号宿主菌通过双平板法计数，并作平行对照，检测其增殖效率。统计后结果见表2和表3。表2.噬菌体Bp4和Bp7对不同宿主菌的增殖效率（噬菌体稀释度1*10-5）噬斑数（个）23号菌25号菌39号菌Bp4+2328232953--Bp4+255851182200--Bp7+397982--208224Bp7+231720--3539表3.噬菌体Bp4和Bp7对不同宿主菌的增殖效率（噬菌体稀释度1*10-6）噬斑数（个）23号菌25号菌39号菌Bp4+23451712--Bp4+25892024--Bp7+391714--3427Bp7+2323--89通过对比不同稀释度的噬菌体在宿主菌中增殖的噬菌斑数量发现，当稀释度为10-6时数据较有代表性，根据该稀释度下噬菌斑计数结果作图，比较噬菌体Bp4和Bp7在其不同宿主菌中的增殖效率，和Bp4和Bp7在其共同宿主菌中的增殖效率。结果见图1-3。图1噬菌体Bp4对不同宿主菌的增值效率图2.噬菌体Bp7对不同宿主菌的增殖效率图3.不同噬菌体在23号菌中增殖效率的比较由图1可知，Bp4的宿主菌是25号和23号菌，Bp4无论在23号菌或25号菌中增殖结果都是一致的，结果显示Bp4在25号菌中的增殖效率比在23号菌中的增殖效率高。由图2可看出，Bp7的宿主菌是39号菌和23号菌，Bp7无论在23号菌或39号菌中增殖结果都是一致的，结果倾向于Bp7在39号菌中的增殖效率比在23号菌中的增殖效率高。由图3可知，Bp4和Bp7在23号菌中都可增殖，为Bp4和Bp7的共同宿主菌，用双平板法检测其增殖效率，用23号菌增殖的Bp4和Bp7与23号菌相互作用后，结果都显示Bp4在23号菌中的增殖效率比Bp7在23号菌的增殖效率高。3.讨论大多数噬菌体依靠感染酶水解宿主菌细胞壁中的肽聚糖从而释放子噬菌体。大分子噬菌体（如双链DNA噬菌体）一般都是通过Holin[10]穿孔素蛋白和感染酶组成的系统共同作用导致细菌感染。Holin穿孔素是噬菌体侵染晚期合成的极性小分子跨膜蛋白，可以导致细菌胞浆膜非特异的损伤，其作用是能在细菌细胞膜上打孔而破坏细胞膜，形成稳定的跨膜孔，使细胞膜对噬菌体感染酶的通透性增强，进而聚集在细菌胞浆中的感染酶可以穿过细胞膜发挥感染细胞壁的作用，最终使宿主细菌杀死，这种从细菌内部的感染方式称为“自内感染”[11]。噬菌体侵染细菌后控制宿主的代谢机制为其复制大量子代病毒粒子，整个过程大致包括下述5个阶段：（1）吸附：噬菌体的吸附专一性很强，只能吸附在于其结构和静电互补的细菌表面，如大肠杆菌细胞壁的脂蛋白是TT和T噬菌体的吸附部位（2）穿入和脱壳：噬菌体尾丝触及大肠杆菌细胞表面特殊受体部位就可触发颈须把卷紧的尾丝散开，并粘在受体上，尾部受到一种构型的刺激，使尾钉、尾板固着在细胞表面。由于尾鞘携带少量酶把细胞壁局部肽聚糖溶解而产生小孔，以及尾鞘含有ATP和ATP酶可提供能量，使尾鞘的衣壳粒发生复杂的位移把尾鞘插入细胞壁和细胞膜中，头部的核酸经中空的尾髓注入细胞内，衣壳留在胞外（3）生物合成：病毒核酸一经裸露，就接管细胞的代谢机器，利用细胞的核糖体、能量、转移RNA和酶，以细胞降解产物或贮存物质及进入胞内的营养物作原料，复制病毒的核酸和合成病毒的蛋白质。（4）装配：装配式新和成的病毒核酸和蛋白石在宿主细胞内组装子代病毒粒子的过程。（5）释放：病毒粒子装配完成后，就能从感染的细胞内释放到胞外[12]。纯化的噬菌体感染酶可作用于细菌细胞壁特有的肽聚糖，同时引起细菌细胞感染。由此可见，研究本实验室分离纯化的两种噬菌体对大肠杆菌的治疗有着极其重要的作用,为大规模生产制造噬菌体病毒提供了有力的理论依据。本实验结果表明Bp4对23号菌的增殖效率比对25号菌的增殖效率较高；Bp7对23号菌的增殖效率比对39号菌增殖效率高；Bp4对23号菌的感染性比对Bp7对23号菌的感染性高。同一噬菌体对不同宿主菌感染性不同，可能是由于不同的的大肠杆菌表面的肽聚糖受体不同所导致。利于噬菌体结合的受体含量越高，两者相互结合越顺利，则噬菌体的增殖效率越高。反之，则增殖效率越低。同时噬菌体是典型的非细胞结构，属于专性寄生型微生物，非寄生状态下不表现生命特征，其全部生命周期即感染并感染细菌的周期，主要过程为吸附宿主、注入核酸、核酸复制及表达、子代合成、细菌细胞破裂[13]。不同噬菌体拥有不同的生命周期，潜伏期越短，感染周期完成越快，本实验在同一条件及同一时间下进行增殖，如果出现噬菌体感染周期的差异，则可能造成效价的高低不同。噬菌体的感染速度即噬菌体感染宿主菌后，在多长时间出现细菌感染现象[14]。由于实验所用的T4类的噬菌体Bp7属肌尾科噬菌体，所用N4类噬菌体Bp4属短尾噬菌体科。T4噬菌体感染细菌时，是通过其长尾丝蛋白gp37与大肠杆菌的脂多糖外膜中的二糖基残基或大肠杆菌OmpC蛋白细胞表面位点结合。N4类噬菌体Bp4由于尾丝较短，与Bp7对同一宿主菌的感染速度不同，造成最终效价不同。感染复数（MOI）是研究病毒初始感染与产量之间的一个重要生物学指标[15]。对噬菌体来说，感染复数是指初始感染时，加入噬菌体的量与宿主菌的量之间的比值。若MOI>1即表示每个细菌可能会被1个以上的噬菌体感染；若MOI<1则表示一个细菌平均得不到一个噬菌体感染的机会。在噬菌体增殖初期，没有进行效价的测定，没有统一初始浓度，可能会造成最终噬菌体数量的不同。同时，在进行噬菌体和宿主菌的增殖过程中没有进行效价的测定，实验造成一定的误差，需要进一步进行实验。虽然噬菌体广泛存在与自然界中，但是想得到较纯的噬菌体却不那么简单，在分离时也存在一些问题是需要注意的。除实验本身不可避免的误差外，还可能因操作不当导致结果不准确，因此本实验进行多次，最后取平均值。本实验稀释倍数较高，程序相对复杂，极易出错，因此实验时的每一步做好标记极其重要，发现问题应立即补救。由于实验技术的不熟练，在进行本实验时，不是每一组实验都得到理想的结果，但重复多次试验后，得到较为理想的结果。噬菌体对于细菌性感染疾病的治疗具有抗生素无法比拟的优势：噬菌体可依赖体内的宿主进行复制，因此仅需很小的剂量即可达到治疗目的；噬菌体的裂菌机制与抗生素完全不同，细菌对噬菌体裂产生耐药性的几率远远小于抗生素并且治疗效果不受耐药菌的影响，虽然致病菌为了逃避噬菌体的识别也可能产生抗性。但优于抗生素的是，噬菌体也会随致病菌的变异而发生变异，并产生能感染突变细菌的新噬菌体；噬菌体对宿主菌有较强的专一性要求，对机体正常的微生物菌群影响很小，对机体的副作用较小；噬菌体可单独使用也可与抗生素协同使用，不仅能增强抗菌效果还可以减少抗性菌的出现；对抗生素过敏的患者也可应用噬菌体进行治疗。此外，噬菌体不仅可以用于人类及动物细菌尤其是耐药菌疾病的预防和治疗，还可作为食品添加剂来预防食品的细菌污染，Guenther等报道李斯特氏菌的噬菌体A511在肉制品和乳制品中对李斯特氏菌有一定的控制作用。同时在医疗器械消毒、环境消毒、农业和兽医抗感染等方面也具有潜在的应用价值[16]。噬菌体治疗的历史可以追溯到100多年前。到了80年代，英国科学家就报道了大肠杆菌噬菌体在兽医临床的成功应用。目前噬菌体疗法日益受到重视，2006年8月美国食品和药物管理局批准了一种由噬菌体混合而成的产品，该产品主要用于杀灭肉制品中的李氏杆菌，这是美国第一次批准将噬菌体作为食品添加剂，也标志着噬菌体在食品加工领域得到了正式承认[17]。通过本实验，我们发现噬菌体Bp4、Bp7在不同的宿主菌中的增殖效率不同，表明噬菌体对不同致病菌的感染性不同，这为噬菌体生物制剂的开发提供了理论依据，在噬菌体鸡尾酒研发过程中需要注意噬菌体对不同宿主菌的易感范围，以提高噬菌体的杀菌效果。致谢本次试验及毕业论文的完成，得到了老师的悉心指导，帮助我理清论文写作思路，并对我的论文提出了诸多宝贵的意见和建议。感谢实验室的各位师兄师姐，在百忙之中的热心帮助。最后，再次对所有帮助过我的老师、同学和家人表示由衷的感谢！参考文献[1]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验.北京:高等教育出版社,1999.7[2]Brussow,H.Phagetherapy:theEscherichiacoliexperience.Microbiology,2005,151(7):2133-2140.[3]陆承平.兽医微生物学(第四版).北京:中国农业出版社,2007.215-223.[4]钱存柔.微生物学实验教程.北京:科学出版社,1999.9[5]Savarino,S.J.,Hall,E.RBassily,S.,etal.Introductoryevaluationofanoral,killedwholecellenterotoxigenicEscherichiacolipluscholeratoxinBsubunitvaccineinEgyptianinfants.PediatrInfectDisJ,2002,21(4):322-330.[6]冯书章,刘军,孙洋.细菌的病毒—噬菌体最新分类与命名.中国兽医学报,2007,40(4):604-608.[7]黄熙泰、于自然、李翠凤.现代生物化学.北京：化学工业出版社，2005.[8]LoessnerMJBacteriophageendolysinscurrentstateofsearchandapplicatio.CurrOpinBiotechnol,2005,8(4):480-487.[9]ThackerPD.Setamicrobetokillamicrobe:drugresistance1989,4:14-19.renewsinterestinphagetherapy.AmMed,2003,290(24):[10]DavidL.Nelson,MichaelM.Cox.LehningerPrincipleofBiochemistry.[11]KaramJD,KonigsbergWH.DNApolymeraseoftheT4-relatedbacteriophagesProgrNuclAcidResMolBiol,2000,64:65-96.[12]姜焕焕.大肠杆菌噬菌体IME08的分离鉴定及其裂解酶的表达与活性检测.中国人民解放军军事医学科学院硕士论文，2011.[13]WallSK,ZhangJ,RostagnoMH,etal.PhagetherapytoreducepreprocessingSalmonellainfectionsinmarket-weightswine.ApplEnvironMicrobiol2010,76(1):48-53.[14]朱才众.大肠杆菌菌噬菌体裂解酶基因表达、生物活性鉴定及裂菌动力学研.重庆:第三军医大学.2009:64.[15]SerranoL,DayAG,FershtARStep-wisemutationofbarnasetobinase.Ap