放射自显影课件

第七章放射自显影技术

(Autoradiography，ARG)定义：

放射自显影是一种利用放射性核素发射的核射线，使乳胶中的卤化银感光而形成潜影，经显影和定影，形成图像。借助感光银颗粒所在的部位和强度，通过影像分析，能准确地判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量），这种技术称为放射自显影术。这种技术得到的图像称为放射自显影像（autoradiogram），以上两种术语均可简称为放射自显影（ARG）。

放射自显影技术是利用放射性核素所产生的射线作用于感光乳胶的卤化银晶体而产生潜影，再经过显影定影处理，把感光的卤化银还原成黑色的银颗粒，即可根据这些银颗粒的部位和数量分析出标本中放射性示踪物的分布，以进行定位和定量分析。基本原理潜影形成步骤

1、发射电子：核射线与溴化银作用，使其电离，发射出电子，向敏化中心移动形成阴电层。

AgBr+β粒子→Ag++Br-+e-

2、Ag+的还原：Ag+向敏化中心移动，与e-结合，还原成银原子。e-+Ag+→Ag3、潜影形成：还原的银原子起催化作用，致周围的Ag+被还原，形成潜影。

Ag……Ag→nAg

潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。（二）潜影的消退

有潜影形成的结晶在显影液的作用下，溴被洗去，银原子则留下来成一个黑色颗粒。潜影如未及时显影，则在水、氧等作用下还原的银原子会减少，使潜影消退。故曝光应在干燥、低温、少氧的环境下进行。二、放射自显影的材料原子核乳胶氚片X线胶片主要是感光材料和放射性核素（一）感光材料的种类1、原子核乳胶

简称核乳胶，由溴化银和明胶组成。常温下呈半固体，低温为明胶状，温度升至40℃左右为液态。使用时乳胶涂层厚度可由乳胶量和稀释度（用去离子水稀释）进行调节。由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗粒平均直径1μm，对低能β射线敏感度高，对暗室的安全光也有相当耐受。乳胶涂在醋酸纤维素酯片基的单面，乳胶面没有保护层。使用时要注意保护乳胶层面，该面直接与标本接触，以获得最佳灵敏度。主要用于3H标记化合物的宏观自显影或低倍光镜自显影。2、氚片（tritumfilm）（二）常用的放射性核素选择放射性核素应考虑其射线种类、能量和半衰期。核素半衰期射线类型射线平均能量（MeV）3H

12.33年β0.00514C5730年β0.0532P14.28天β0.69535S87.4天β0.05545Ca165天β0.1059Fe44.6天β0.12125I60.2天β、γ0.00372、光镜自显影(lightmicroscopicARG)

又称光学显微镜自显影，是借助显微镜进行组织或细胞学观察，分辨能力要求较高。根据银颗粒来判断示踪剂的分布部位和数量的多少。适用于组织切片、细胞涂片等标本的研究。可以对不同细胞进行比较，并根据不同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的代谢过程。制备一般采用液体乳胶法。细胞水平的研究3、电子显微镜自显影（electronmicroscopicARG)

用于示踪剂在亚细胞结构中分布情况的研究，能显示出普通显微镜观察不到的细微结构与放射性核素分布的关系。适用于细胞超微结构，甚至大分子（DNA、RNA）上的精确定位和定量，也可观察动态过程。此类技术要求标本在100nm以下的超薄切片，乳胶厚度仅相当银颗粒的直径（约140nm）。超微结构和动态观察（二）放射自显影的基本方法医学生物学示踪研究中的自显影实验，一般环节：1、示踪剂的引入2、标本制备：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片或电泳、层析分离的标本。3、自显影制备：暗室中在标本上敷加感光材料。4、曝光处理：避光条件下核射线作用于感光材料。5、照相处理：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。最后是阅读分析。（1）体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性标记化合物。（2）体外实验：对组织、细胞、体液的培养过程，则可在培养瓶中引入。在离体标本上研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余的示踪剂后再进行自显影。1、示踪剂引入的方法2、放射自显影的标本制备总要求：标本制备过程不能引起示踪剂的流失或移动。组织切片整体小动物或大动物脏器切片牙齿、骨骼体液、培养液中的细胞或其他成分电镜标本无细胞的标本2、整体小动物或大动物脏器切片

实验动物引入示踪剂后，用药物麻醉动物，然后将动物投入干冰丙酮混合液或液氮中快速冷冻，以防组织内形成结晶，待全部冻结，用羟甲基纤维素包埋动物，包埋块在整体切片机上制成切片，再进行自显影操作。3、牙齿、骨骼观察无机成分时，可在磨石上制成磨片。先用10%福尔马林固定，经磨石加水研磨至表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脱水、干燥，再进行自显影。观察有机成分时，可脱钙后制成石蜡切片。5、电镜标本

电镜标本的制备与一般标本制备不同，标本先用2%戊二醛固定，缓冲液洗涤，再用锇酸固定，冲洗，系列丙酮或乙醇脱水，环氧树脂包埋。然后用超薄切片抽切片，切片厚度为50~100μm。再涂核乳胶，进行自显影。6、无细胞标本

示踪研究所用的各种电泳谱、色层条、免疫沉淀板，可按常规方法进行处理、干燥，然后再用接触法做自显影。（三）自显影片的制备方法接触法液体核乳胶浸膜法揭膜乳胶法融裱法金属环法2、液体核乳胶浸膜法

在暗室中，将标本或载有标本的玻片浸入适当稀释的液体核乳胶中，使标本表面敷上一层薄而均匀的乳胶膜，干燥后曝光而制备处显影的方法称液体核乳胶浸膜法。在浸膜过程中，标本要与含水的液体核乳胶接触，会造成扩散性示踪剂一定程度的扩散和流失，故只适用于非扩散性示踪实验。3、揭膜乳胶法将揭膜乳胶膜从玻璃基片上揭下来，在温水中展开，浸透，然后将其贴于标本表面，干燥后曝光而制备自显影。揭膜乳胶厚度均匀，该法常用于光镜自显影的定量研究。因需在水中进行，故适用于非扩散性示踪实验。4、融裱法用预冷的核乳胶干板沾取刚刚切下的冰冻组织切片，并使其贴牢在乳胶面上，冻干后进行曝光制备自显影。主要用于光镜自显影的扩散性示踪实验。（四）曝射曝射量和示踪剂量：正相关曝射时间(五)照相处理（一）显影和定影（二）显影液和定影液（三）干燥、染色和封固1、显影和定影

感光材料与标本接触后，经射线的作用溴化银晶体形成潜影，未受核射线作用的溴化银则不形成潜影。这两种晶体经显影和定影，才能将其区分。显影的作用是使银盐还原，有潜影的结晶比无潜影者显影快，因此适当控制显影时间可只使受照射的结晶呈现黑色颗粒，定影的作用是洗去未感光的银盐。2、显影液和定影液显影和定影是由显影液和定影液来完成的。常用的显影液为D-19b，定影液为F-5。显影液和定影液的温度应严格控制在19±1℃，显影时间2-4min。显影结束后用水充分漂洗，然后进行定影。定影时间4-8min，经水充分冲洗后晾干。显影和定影的具体时间可通过实践选定。D-19b显影液和F-5定影液配方

D-19b显影液配方

F-5定影液配方水（5℃）(ml)700水（5℃）(ml)800米吐尔（g）2硫代硫酸钠(g)240无水亚硫酸钠(g)72无水亚硫酸钠(g)15对苯二酚（g）8.828%醋酸(ml)48无水碳酸钠(g)48硼酸(结晶)(g)7.5溴化钾(g)4钾矾(g)15加水至(ml)1000加水至(ml)10003、干燥、染色和封固

经显影、定影和冲洗等处理的乳胶可空气或人工干燥，但干燥过程应避免尘粒沾污乳胶，也可用酒精进行脱水干燥。干燥后可按常规方法染色（如苏木精-伊红），染色后可用盖玻片封固。第四节放射自显影的影响因素一、放射自显影的分辨力放射自显影的目的在于研究放射性核素或其标记化合物在组织内的位置，所以放射自显影的分辩力，主要是指位置的分辩力。故分辨力就是指两个相邻的放射性核素分子在标本中的距离近到多少能在显影银颗粒上显示为两个颗粒。银颗粒显影放射源可分辨不可分辨（一）放射自显影的分辨力半距离（halfdistance，HD）

衡量分辨力常用半距离来表示。即一线性放射源，其显影的银颗粒分散在放射源的两侧，银颗粒随着与放射源的距离的增加而减少，当银颗粒减少到一半时，此距离称半距离。若放射源为点状源则以半半径来表示。HD（二）影响分辨力的主要因素1、核素的能量：核素的能量越高，射线的射程越长，分散的银颗粒就较多，因而分辨力下降。如在相同条件下，3H、14C、32P的自显影分辨力依次下降。射线能量低的自显影射线能量高的自显影2、样品的厚度：样品厚，组织表面和深层中放射源的射线同时射入乳胶层，使银颗粒分散程度加重，影像重叠，分辨力下降。样品薄，则分辨力高，但曝光时间需加长。薄样品自显影厚样品自显影3、乳胶层的厚度：较薄的乳胶层记录的是离放射源最近的径迹起始部，随乳胶加厚，记录的包括径迹起始部和远离放射源的部分，偏离放射源的机会越多，分辨力下降。乳胶层厚，形成较大的影像4、样品与乳胶层的间隙：距离大者，射线散射面积也大，影像越不清晰，分辨力下降。样品与乳胶层间隙大，形成较大显影5、乳胶银晶体大小和密度：显影银颗粒不一定于原有的卤化银位置完全一致，故银晶体越小，则显影银颗粒越小或致密者，分辨力就越好。6、曝光时间：正常曝光时间，核素中占多数的中、低能量射线作用于乳胶，分辨力高。时间过长，则高能射线作用乳胶几率增加，散射加大，分辨力下降。7、显影时间：显影时间长，可使一些未感光的银粒被还原，使影像界限不清，分辨力下降。二、放射自显影的本底在自显影上，除标本内的放射性核素外，由其他原因造成的显影颗粒，统称自显影的本底。本底过高不仅降低放射性的测量水平，而且降低分辨力。暗室红灯过量或感光材料在红灯下曝露时间过长、显影液温度过高或时间过长、感光材料过期或保存温度过高、感光材料的机械弯折或涂液体乳胶干燥过快以及感光材料沾污还原性物质等，是引起自显影本底过高的常见原因。三、放射自显影的效率

系指待测标本中的放射性核素在曝光时间内，每100次衰变所给出的显影银粒数目。粗略估计，当3H标本的厚度为1μm、密度为1.1时，光镜自显影中的效率为10%~15%，而厚度为5μm者，效率则为4%~5%（很多深层β粒子不能从标本中射出）。32P标本在同样条件下的效率为30%~40%，在电镜自显影中，3H的效率为25%。四、示踪剂量和曝射时间五、扩散性示踪剂第五节自显影的阅读分析（一）宏观自显影的阅读分析（二）光镜自显影的阅读分析（三）电镜自显影的阅读分析（一）宏观自显影的阅读分析

宏观自显影的影像可直接用肉眼观察。比本底黑的部份即表示放射性示踪剂的存在，黑度越大，表示该处放射性越强，示踪剂分布越多。观察时，需将自显影像与标本重合起来观察，以准确定位。如将自显影像用光密度计进行测量，则可进行定量分析。（二）光镜自显影的阅读分析

通过在光镜下观察自显影像上银颗粒分布的位置和密度而确定放射性示踪剂存在部位和数量。自显影像上单位面积的显影银颗粒数目，与该处示踪剂的放射性活度呈正比。光镜自显影的定量分析

二种方法一是计数被示踪剂标记的细胞或细胞核在细胞群体中所占的百分率，即标记指数。通常一个细胞核上有4个以上银颗粒作为标记细胞。另一种是计数自显影像上某部位单位面积（用显微镜测微尺测量面积）上银颗粒数目，或计数某种组织细胞上的银颗粒数目。（三）电镜自显影的阅读分析一般在电镜照片上进行，可以通过银颗粒的位置、数目来确定放射性示踪剂在亚细胞结构的分布，以及数量。第六节放射自显影在生物医学中应用的一些实例在药理学方面的应用在神经科学方面的应用细胞生物学与分子生物学方面的应用（细胞动力学、血液细胞学研究、细胞迁移实验、电泳凝胶上放射条带的检测、基因芯片的放射自显影）一、物质在体内的分布、代谢用放射性自显影可动态观察生理或病理状态下放射性核素标记的各种药物、毒物、营养物质等在脏器、组织、细胞中的分布、转运、蓄积和排泄，以研究其代谢规律、作用部位及作用机理等。二、生物活性物质的合成、代谢研究以适宜的放射性核素标记某些生命物质的前体，如DNA的特异性前体胸腺嘧啶核苷、RNA的特异性前体尿嘧啶核苷、蛋白质的特异性前体氨基酸、类固醇激素的前体胆固醇等，用自显影追踪这些标记前体在组织、细胞中的部位、参入数量、参入时间、影响因素以及合成产物的转运情况等，可以研究各种生物活性物质在体内或细胞中合成、代谢的部位、动态及其机理，还可由此了解细胞功能，应用十分广泛。三、特异性抗原、受体、DNA片段等的分布用标记抗体、标记受体的配基或互补RNA（DNA）等，将这些特定的标记物引入体内或与离体组织细胞标本反应，根据这些特定的标记物在体内或标本分布的情况，以揭示与它们有特异亲合力的抗原、受体、DNA片段在组织、细胞中的分布，以进行深入的机理研究。四、其他方面应用放射自显影还在分子生物学研究中的限制性内切酶图谱分析、DNA和RNA的序列分析、DNA指纹图谱分析，生物化学中的各种电泳图谱、层析图谱以及免疫学研究中的各种免疫沉淀反应中被用于显示不同处理或反应后标记物的位置和数量。JamwsJamieson和GeorgePalade是如何用同位素示踪技术研究胰泡细胞中蛋白质分泌的?答:胰腺系统中胰泡细胞具有最发达的内膜系统,主要功能是合成消化酶类。这些酶类合成之后要从胰腺系统经由导管分泌到小肠中行使功能。这些酶是如何分泌出去的?JamwsJamieson和GeorgePalade使用放射自显影技术得到了答案。

将一小块胰腺组织放在加有放射性同位素标记氨基酸的培养液中进行短暂培养，在此期间，活细胞就会摄取具有放射性的氨基酸并掺入到核糖体合成的消化酶中，然后立即将组织进行固定，通过切片和放射自显影检测，发现放射性出现在内质网，说明蛋白质的合成始于内质网。

为了检查蛋白质合成后的运输路线,他们还进行了一系列脉冲追踪实验(pulse-chaseexperiment)，即将组织置于加有放射性同位素标记氨基酸的培养液中进行短暂培养，然后将组织洗净再置于无同位素的培养基中培养不同时间再进行组织固定和放射自显影术检测。蛋白质分泌的同位素示踪实验示意图

(a)细胞与同位素接触3分钟之后，标记物出现在内质网中;(b)细胞接触同位素3分钟后,置于非同位素的培养基中“跟踪”17分钟,放射性标记出现在高尔基体和部分分泌泡;(c)细胞接触同位素3分钟后，置于无同位素的培养基中“跟踪”117分钟,标记物主要出现在分泌泡中。检测的结果表明：追踪培养的时间越长，同位素标记的蛋白离开合成部位越远，分泌蛋白在内质网合成后转移到经高尔基体，再转移到分泌小泡和细胞外。思考题一、定义放射自显影、自显影的分辨力二、简答1、放射自显影的原理？2、放射自显影的基本方法？3、放射自显影在生物医学中的应用？三、填空1、自显影曝光时应在干燥、低温、少氧的环境中进行。2、衡量自显影的分辨力常用半距离表示。3、自显影的类型有宏观ARG、显微镜ARG和电镜ARG。4、显影的作用是使银盐还原为银颗粒，常用的显影液是D-19b，定影的作用是洗去未感光的银盐，常用的定影液是F-55、影响自显影分辨力的因素有核素能量、样品厚度、乳胶层厚度、样品与乳胶层的间隙、银晶体的大小、曝光时间和显影时间。在分子生物学中，放射性核素示踪技术起到了十分重要的作用。当前，核酸序列分析和核酸分子杂交中最常用的示踪手段是放射性核素示踪技术。尽管其他的非放射性示踪技术进展迅速，但核素示踪技术仍是其金标准，具有不可替代性。第五节核酸探针标记技术核酸探针是指一段用放射性核素或其他标记物(如酶与荧光素等)标记的DNA片段、单链DNA和RNA。

核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。

核酸探针技术

利用核苷酸碱基序列互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列(靶序列)的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。核酸探针的标记标记物是否为核素核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等；非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等。核酸探针的种类（性质和来源）cDNA探针基因组DNA探针寡核苷酸探针RNA探针探针标记方法放射性核素标记有体内标记法及体外标记法

体外标记法不需要活体生物，所得探针放射性较高。故一般用体外标记法。体外标记法有两种：化学法和酶法。

化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应而进行标记，标记物直接与核酸分子相连。酶法是先将标记物标记在核苷酸上，然后再通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生核酸探针。常用的有切口平移法、随机引物法、未端标记法。核酸探针标记方法缺口平移法(nicktranslation)随机引物法(randomprimer)：末端标记法(同位素标记探针的方法)PCR参入法缺口平移法

原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单链的不同位置上造成随机切口，然后在存在着一种已标记dNTP底物的体系中用大肠杆菌聚合酶I（polI）进行5’→3’修复合成，在这个反应过程中将已标记的dNTP合成进DNA链中。DNA全链标记缺口平移法（用于标记双链DNA）3’5’5’3’DNA酶IMg++双链DNA带切口的DN