神经实验5 小鼠脑片免疫组织化学

实验5小鼠脑片免疫组织化学（SABC法）实验一、实验目的了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验操作步骤。二、实验原理免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。三、实验器材略四、实验步骤1.载玻片准备将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。盖玻片直接泡酸，其余处理步骤同载玻片。处理后的载玻片用稀释度为1：10的多聚赖氨酸浸泡5min，37℃2.取材昆明品系小鼠，用0.4%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室快速灌注37℃生理盐水及4℃、4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液各50ml，开颅取脑，后固定2小时；用0.01M的PBS冲洗脑中的残留固定液，重复6次，每次1h；再依次移入75%、80%、95%及100%的梯度酒精中脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋后，进行连续石蜡冠状切片，片厚约5μm；42℃温水中漂片，然后将切片放入45℃恒温箱中烤片3.操作步骤3.1石蜡切片脱蜡至水化：二甲苯I、二甲苯II各5min，100%乙醇2min，95%、80%乙醇各1min，蒸馏水2min。3.2灭活内源性过氧化物酶：切片入3%H2O2，室温浸泡10min，。蒸馏水洗2次，每次5min。3.3热修复抗原：切片浸入枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0）,水浴加热，92-98℃10min,电炉断电，再重复一次。室温下自然冷却。0.02MPBS（PH=7.4）洗3次,每次5min3.4封闭内源性生物素：滴加5%BSA封闭液，室温下20min。甩去多余液体，不洗。3.5免疫组织化学染色3.5.1滴加稀释度为1：100的兔多克隆抗体c-fos,4℃冰箱中孵育过夜。0.02MPBS洗3次，每次5min3.5.2滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，37℃恒温箱中孵育30min。0.02MPBS洗3次,每次5min3.5.3滴加SABC，37℃恒温箱中孵育30min。0.02MPBS洗4次,每次5min。3.5.4DAB显色：取1ml蒸馏水，加入A，B，C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温避光显色，显微镜下控制反应时间，一般5-30min。自来水冲洗中止显色。3.5.5封片：蒸馏水洗2min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜观察结果，染成棕黄色的切片为c-fos表达阳性。4.图像分析选取完好切片4张，分别对每张切片的海马CA1区、CA3区、齿状回、前脑皮层进行显微拍照（×400）；利用MoticImagesAdvanced3.2图像处理系统测量c-fos阳性细胞的平均目标灰度值和阳性细胞数。灰度值代表所测阳性细胞的平均灰度，与免疫反应的强弱呈反比关系。取4张切片，计算各区平均目标灰度值与阳性细胞数的平均值，作为每个个体各区最终的灰度值和阳性细胞数。染色图参考（海马区域c-Fos蛋白）五、注意事项内源性生物活性及其消除生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基中间载体，在应用ABC法染色时会与抗生物素蛋白结合而产生非特异性染色。对含内源性生物素或生物素样物质较丰富的组织，在应用ABC法前，应预先以0.01％的抗生素蛋白和0.01％生物素溶液分别作用20分钟左右，以消除内源性生物素活性。每次作用后应用PBS洗5分钟，更换3次。此外，链霉抗生素蛋白（streptavidin）由于其分子中不含寡糖及等电点接近中性（6－6.5），故非特异性吸附很低。同时链霉抗生素蛋白可与长臂生物素及过氧化物酶结合成复合物，此为SABC（streptavidin-Biotin-peroxidaseComplex）复合物，用SABC取代ABC进行标记，可提高灵敏度（比ABC高约20倍）及降低非特异性着色。现在SABC已有成品的试剂盒出售。SABC法的操作步骤基本与ABC法相同，只不过要用SABC代替ABC标记，此外第一级抗体和第二级抗体的孵育时间均可缩短至30分钟以内，故SABC法是一个快速、简便、敏感及非特异性着色低的检测方法。生物素制剂间相互亲和性差异很大，因此在应用ABC试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先预测，以保证实验结果的稳定性。标记过程中应始终保持组织切片的湿润。4、在用PBS缓冲液冲洗的过程应尽量冲洗完全，片子表面不留杂质。6、准确配比抗体的浓度，因为浓度过高和过低都不利反应地进行，在滴加抗体的时候，做到用量少而均匀。7、DAB是有毒试剂，使用过程中尽量不污染周围环境，并且显色过程中尽量避免DAB见光分解。8、滴加每种试剂做到迅速