基因工程与基因重组

基因重组与基因工程生物工程定义生物工程是生物技术的总称，是对生命有机体在分子水平、细胞水平、组织水平、个体水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。生物技术的四大体系基因工程细胞工程酶工程发酵工程

重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecularcloning）。一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆

由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（genecloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。1997年2月23日英国Wilmut

从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。用合适的酶切割目的基因和载体，产生匹配的末端在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。

筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子重组质粒目的基因大肠杆杆菌转(转转化)染色体体真好玩!筛(筛筛选)分解抗抗生素素的酶酶含抗生生素的的培养养基还活着着!玩完啦啦!大肠杆杆菌大肠杆杆菌大量生生长提取大大量质粒酶切鉴定您已经经掌握握基因因克隆隆的主主要步步骤！！分离目的的基因因和载载体DNA。用合适适的酶酶切割上述述两者者，产产生匹匹配的的末端端。连接酶将目目的基基因装装入载载体。。转入细菌菌。筛选具有有抗药药性克克隆。。（二））重组组DNA中中的工工具酶酶限制性性核酸酸内切切酶连接酶酶聚合酶酶多聚核核苷酸酸激酶酶碱性磷磷酸酶酶1.限限制制性核核酸内内切酶酶（restrictionendonuclease））定义：：能识别别DNA的特异序序列，并在在识别别位点点或其其周围围切割双双链DNA的一类类核酸酸内切切酶。。主要来来源于于原核核生物物，可可将侵侵入宿宿主细细胞的的外源源性DNA迅速速降解解，而而对细细菌自自身的的DNA，，则通通过甲甲基化化酶在在该限限制酶酶切位位点甲甲基化化修饰饰而保保护自自身的的DNA不不被降降解。。限制性内内切酶和和甲基化化酶共同构成成细菌的的限制和修修饰系统。限限制性内内切酶由由于能限限制外源源DNA的“入入侵”而而得名。。限制酶的的命名限制酶的的命名是是根据含含有该酶酶的微生生物种属属而定。。通常有有三个斜斜体字母母的缩写写表示。。第一个大大写字母母取自细菌属名名的第一个个字母；；第二、三三个小写写字母取自微生生物种名的头两个个字母；；第四个字字母代表该微微生物同同种内不不同的株系；如果同同一株名名发现几几种限制制酶，则则根据其其被发现现和分离离的先后后顺序，，用罗马数字字表示。例如，从从大肠杆杆菌（EscherichiaColi）RY13株中发现现分离的的第一种种限制酶酶，称为为EcoRI。。限制性内内切酶的的分类和和特点根据限制制酶的组组成、辅辅因子及及切割DNA方方式不同同，可分分为I、II、III型。。重组DNA技技术中常常用的是是II型限限制性内内切酶。II型型酶作用用特点是是有严格格的识别别、切割割顺序，，以内切切方式水水解双链链DNA中的磷磷酸二酯酯键，产产生的DNA片片段5'端端为磷酸酸基，3'端端为羟基基。识别顺顺序一般般为4~6个碱碱基，通通常是回文结构构（palindrome））。回文结构构II类限限制性核核酸内切切酶识别别DNA位点点的核苷苷酸序列列呈二元旋转转对称，通常称称这种特特殊的结结构顺序序为回文结构构。EcoRI5'……GAATTC…3'3'……CTTAAG…5'II型酶酶切割双双链DNA产生生3种不同的切切口：在对称轴中中心同时切割割双链，，产生平末端或称钝性性末端（（bluntend），如如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'在对称轴两两侧相对对位点分别切割割一条链链。从5’端端切割产生生5'端端突出的的粘性末末端，如EcoRI：：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'从3'端端切割产生生3'端端突出的的粘性末末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'表15-2一些常用的限制性内切酶位点一些限制制酶虽然然识别序序列不完完全相同同，但能能产生相相同类型型的粘性性末端，，称为同尾酶，所产生生的末端端称配伍末端端（compatibleend），可进行行相互连连接。产产生平末末端的酶酶切割DNA后后，也可可彼此连连接。连接酶可催化化DNA分子子中相邻5'磷酸和3'羟基末端之间形成成磷酸二酯键，使DNA切切口封合或使使两个DNA分子或片段段连接。常用用的有T4（噬菌体）DNA连接酶酶和E.ColiDNA连接酶酶。2.DNA连接酶3.聚合酶酶重组DNA技技术中，聚合合酶（polymerase）的最最重要作用是是以DNA或或RNA为模模板在体外合合成DNA或或RNA。可可分为DNA聚合酶酶和RNA聚合酶酶两大类。

名称 功能及应用 大肠杆菌DNA聚合酶I以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有3’→5’的外切酶

大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。TaqDNA聚合酶以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。末端转移酶催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA3’-OH连接而使DNA链延长，无需模板。常用于3'端标记或形成DNA共聚尾巴。逆转录酶以RNA为模板，合成cDNA链（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。T4多核苷酸激酶酶（polynucleotidekinase）催化化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的的5'末端羟羟基上。常用于单单链或双链DNA和RNA探针的5'端标记记。4.多聚核核苷酸激酶5.碱性磷磷酸酶牛小肠碱性磷磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP）），催化DNA或RNA的5'磷酸基基水解。常用于去除除线状载体DNA两端的的5'磷酸酸基团，防止载体自身身连接环化；也用于用32P标记DNA的5'末末端之前除去去原来的5'磷酸基。。应用重组DNA技术有时时是为分离、、获得某一感兴趣的基因因或DNA片片段，或是获得感感兴趣的表达达产物———蛋白质。这些感兴趣趣的基因或DNA序列就就是目的基因因。目的基因因有两种类型型，即cDNA和基因组DNA。（三）目的基基因（targetgene）（四）基因因工程载体基因载体：或称克隆载体（cloningvector）,是在基因工工程中为“携携带”感兴趣趣的外源DNA（目的基因、外外源基因）、实现外源源DNA的无无性繁殖或表表达有意义的的蛋白质所采采用的一些DNA分子，，具有自我复复制和表达功功能。其中，，为使插入的的外源DNA序列可转转录、进而翻翻译成多肽链链而特异设计计的克隆载体体又称表达载体。能自主复制并能带动插入的的目的基因因一起复制制。具有一个以以上的单一一限制性酶切切位点（多多克隆位点点，multiplecloningsites），，以便目的的基因的插插入。具有合适的的筛选标记（如抗药性性基因，酶酶基因等）），以便筛选阳性性克隆。载体分子量小，以便容纳纳较大目的的基因，拷拷贝数高。。在细胞内稳定性高，以便确保保重组体稳稳定传代而而不易丢失失。理想载体应应具备的基基本条件载体的分类类

质粒（plasmid）

噬菌体（phage）

病毒（virus）

克隆载体（cloningvector）

表达载体（expressionvector）常用的载体体按来源分分为载体按得到到的产物分分类可分为为质粒（plasmid）质粒是存在在于细菌染染色体外的的小型环状双链DNA分子，能在在宿主细胞胞独立自主地地进行复制制，并在细胞胞分裂时保保持恒定地地传给子代代细胞。质质粒带有某某些遗传信息，会赋予宿宿主细胞新的遗传性性状。因为质粒粒DNA有有自我复制制功能及携携带遗传信信息等特性性，可作为为重组DNA操作作的载体。。染色体质粒pBR322质粒粒图谱氨苄青霉素素抗性基因因四环素抗性性基因多克隆位点点噬菌体载体体噬菌体是一种细菌菌病毒，可可作为克隆隆载体。目前使用的的噬菌体载载体主要有有λ噬菌体衍生物载体体、M13噬菌体载体等。除除M13噬菌体载体体外，这类类载体的特特点是其容量比质质粒粒载载体体大，即即可可插插入入较较大大的的外外源源DNA片片段段（（如如20kb以以上上））。。可以以在在体体外外包包装装产产生生感感染染性性很很高高的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。。噬菌菌体体头部尾部尾丝λ噬菌菌体λ噬菌菌体（（lambdlabacteriophage））是一一种大大肠杆杆菌病病毒，，为线性双双链DNA，它的的两端端各有有12个碱碱基的的互补粘粘性末末端，称COS位点点。当噬噬菌体体侵入入宿主主细胞胞，两两个粘粘性末末端互互补结结合，，形成成环状分分子。λDNA在体体外可可包装装成病病毒颗颗粒，，并高高效感感染大大肠杆杆菌。。λ噬菌菌体侵侵入细细菌后后，即即可裂解生生长（环状状DNA在在细菌菌中多多次复复制，，合成成大量量噬菌菌体基基因产产物，，装配配成噬噬菌体体颗粒粒，裂裂解宿宿主菌菌），，又可可以溶源生生长（λ噬噬菌体体DNA整整合到到细胞胞染色色体基基因组组DNA中中，与与染色色体DNA一起起复制制，并并遗传传给子子代细细胞，，宿主主细胞胞不被被裂解解）。。噬菌体体感染染细菌菌示意意图裂解生生长λ噬菌菌体基基因组组中有有较大大区域域仅与与溶源源生长长有关关，而而对裂裂解生生长并并非绝绝对需需要，，因此此可以以缺失失或被被外源DNA取代。。经改改造的的λ噬噬菌体体衍生生载体体可分分两类类:一类是是插入型型载体体，即外外源基基因插插入到到载体体上单单一的的限制制酶位位点，，如λλgt系列列等。。另一类类是置换型型，即两两个限限制酶酶位点点之间间的DNA片段段可被被外源源DNA取取代，，如Charon，，EMBL系列列等。。M13噬菌体体载体体M13噬菌体体基因因组是是单链环环状DNA，当它它侵犯犯宿主主菌后后，在在细菌菌胞内内酶的的作用用下，，单链链DNA转转变成成复制制型双双链DNA，可可提取取出来来做基基因重重组。。经改造的M13噬菌体有M13mp系列和pUC系列。。M13噬菌体载体——pUC19α互补：单独存在的的α及ω片段都没有半半乳糖苷酶的的活性，只有有宿主细胞与与克隆载体同同时表达两个个片段时，宿宿主细胞内才才有半乳糖糖苷酶活性，，使特异性作作用物（X-gal）变变为蓝色化合物。突变型lac-E.coli表达β-半乳糖苷酶的的ω片段。如果插入的外外源基因是在在lacZ’’基因内，就就会影响lacZ’的表表达，利用lac-E.coli为转染或感染染细胞，在含含X-gal的培养基上上生长时会出出现白色菌落；若无外源基基因插入，则则出现蓝色菌落。多克隆位点编码β-半乳糖苷酶的α片段病毒载体是一类真核载体，能把基因引引入到真核核细胞中，并并在其中被表表达。因此是是研究真核细细胞表达及调调控的有力工工具。如:腺腺病毒、逆转转录病毒、乳乳头瘤病毒等等。二、重重组DNA技术术基本本原理理目的基基因的获取取克隆载体的选择择和构构建外源基基因与与载体体的连接重组DNA导入受受体菌菌重组体体的筛选克隆基基因的的表达（一））目的的基因因的获获取化学合合成法法基因组组DNAcDNA聚合酶酶链反反应1.化化学合合成法法已知某某种基基因的的核苷苷酸序序列，，或根根据某某种基基因产产物的的氨基基酸序序列推推导出出编码码该多多肽链链的核核苷酸酸序列列，再再利用用DNA合成成仪通过化化学合合成原原理合合成目目的基基因。。利用该该法合合成的的基因因有：：人生生长激激素释释放抑抑制因因子、、胰胰岛素素原、、脑脑啡肽肽、干干扰素素基因因等2.基基因组组DNA利用限制性性核酸酸内切切酶将染色色体DNA切割割成一一定基基因水水平的的许多多片段段，将将这些些片段段与适适当的的克隆隆载体体拼接接成重重组DNA分子子，继继而转入受受体菌菌扩增，，使每每个细细菌内内都携携带一种重组DNA分子子的多多个拷拷贝。。不同细细菌所所包含含的重重组DNA分子子可能能为不不同的的染色色体DNA片段段，这这样全全部转转化细细菌所所携带带的各各种染染色体体片段段就代代表了了染色色体的的整个个基因因组。。存在在于转转化细细菌内内、由由克隆隆载体体所携携带的的所有有基因组组DNA片片段的的集合合称为基因组组DNA文文库（genomicDNAlibrary））。基基因组组DNA文文库涵涵盖了了基因因组全全部的的遗传传信息息。建立基基因组组文库库后，，需结结合适适当筛选方方法从众多多转化化子菌菌落中中选出出含有有某一一基因因的菌菌落，，再进进行扩增，将重重组DNA分离离、回回收，，以获获得目目的基基因。。3.cDNA把细胞胞总mRNA通过逆逆转录录合成成总cDNA，再与与适当当载体体连接接后转转入受受体菌菌，从从而得得到含含有某某种生生物体体全部部cDNA集合合（称称为cDNA文文库库，cDNAlibrary）。。然后后用适适当的的方法法从cDNA文文库中中筛选出目的的cDNA。cDNA文文库的特点点是它它只包包括已已经被转录成mRNA的那些基因序列，且不包括内含含子及调控控序列，所以cDNA文库库的复杂性性要比基因因组文库低低的多。但由于不同同的细胞类类型、发育育阶段以及及细胞所处处的特定状状态是由特特定基因的的表达所决决定的，因因此各自的的mRNA种类就不不同，由此此产生的cDNA又又是独特的的。与基因因组DNA文库类似似，由总mRNA制作的cDNA文库库包含了细细胞表达的的各种mRNA信息息，自然也也含有我们们感兴趣的的编码cDNA。4.聚合合酶链反应应（polymerasechainreaction,PCR））参见437页ChainReactionPolymerasechainreactionPCR的产产物数目以指数级方方式增长中子的释放放数目以指数级方方式增长中子原子核短时间内巨巨大的能量释放，，原子爆炸DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(ug)PCR的的基本原理理体外高效、快速速、特异地扩增目的的基因或DNA片段段的技术。其原理类似似于DNA的体内复复制，只是是在试管中中给DNA的体外合合成提供一一种合适条条件——模模板DNA，寡核苷苷酸引物，，DNA聚聚合酶，合合适的缓冲冲液系统和和DNA变变性、复性性及延伸的的温度与时时间等，使使目的DNA得以迅速扩扩增DNA的体体内复制：：原料：模板DNA（基因组DNA），随机小分子子RNA引引物，dNTPs酶：DNA聚合合酶，解旋旋酶，引发发酶反应条件：：胞液环境，，37℃℃反应过程：：模板DNA解旋、引引发体的形形成、延长长（三阶段））产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增增加一倍原料：模板DNA（基因组DNA，cDNA）一对特异性寡核苷酸引引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合合酶反应条件：：合适的缓冲冲液，三种种变化的温度度（94，50-70，72℃℃），一一定的循环数（25-35）反应过程：：DNA模板板变性（解解链）、模模板与与引物退火火、引物物延伸（三阶段，，多循环）产物：目的DNA（特异性））拷贝数增增加2n倍PCR：DNA模板板变性与体内DNA解链过过程不同，，PCR中中作为模板板的双链DNA是通过95℃左右的的高温使其发生变变性，形成成单链DNA模板与引物物退火PCR通通常常需需要要两两条条寡核核苷苷酸酸链链作为为DNA合合成成时时的的引物物（primer））,这这两两个个引引物物分分别别与与待待扩扩增增模模板板DNA的的目标标片片段段两端端的的序序列列互互补补。。在在降降低低温温度度的的过过程程中中，，通通过过控控制制退火火条条件件，引引物物就就能能准准确确地地与与扩扩增增区区域域的的两两端端配配对对。。primers⑴引引物物短，不不易易缠缠绕绕；；⑵设设计计的的引引物物是是与与模模板板DNA两两端端序序列列互互补补；；⑶引引物物的的量量远大大于于模板板分分子子的的量量，，引引物物与与模模板板DNA形形成成双双链链的的几几率率远远远远高高于于DNA分分子子自自身身的的复复性性。。引物物延延伸伸在PCR反反应应体体系系中中的的DNA聚聚合合酶酶，能能够够催催化化反反应应体体系系中中游游离离的的单单核核苷苷酸酸（（dNTPs））由由引引物物5'→→3'方方向向，，按按碱碱基基配配对对的的原原则则延延伸伸，，形形成成两两条条与与模模板板DNA互互补补的的复复制制链链。。Taq酶dNTPS新合成的的链又可可作为下下轮循环环反应的的模板。热变性-复性-延伸的过程就就是一个个PCR循环每每一循循环后的的模板均均比前一一循环增增加1倍倍。理论论上讲，，扩增DNA产产量是呈呈指数上上升的，，即n个个循环后后，产量量为2n拷贝。而而实际上上，PCR的扩扩增倍数数为（1+X）n，X为扩扩增效率率，平均均为75%热变性-复性-延伸25-35次循环百万倍扩增尽管PCR扩增增DNA非常有有效，但但目的DNA序序列的指指数扩增增并不是是一个无无限制的的过程。。在正常的的反应条条件下，，经30次循环环之后，，酶的催催化反应应趋于饱饱和，就就会出现现平台效应(Plateau)，产物的量量不再增加加。“平台效应应”出现的的迟早还取取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓浓度等多种因素素。（三）外源基基因与载体的的连接（二）克隆载载体的选择粘性末端连接接平端连接同聚物加尾连连接人工接头连接接1.粘性性末端连接外源DNA片片段与载体用用同一种限制性内切酶酶切割，获得得相同的粘性性末端，相互互互补配对，，在DNA连连接酶作用下下，形成重组组DNA分子子。5’…C▼CGG…3’5’…C▼CGG…3’3’…GGC▲C…5’3’…GGC▲C…5’HpaII2.平端端连接因载体分子和和目的DNA分子之间并并不一定都产产生互补的粘粘性末端，有有的限制性内内切酶只能切切成平末端。平末端仍用用T4DNA连接酶酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高高。3.同同聚物加尾连连接同聚物加尾连连接是利用同同聚物序列，，如polyG与polyC之间间的退火作用完成连接接。在末端转移酶作用下，在DNA片段末末端加上同聚聚物序列，如如将poly（dC）加加到双链DNA片段3'羟基上，，而将poly（dG））加到质粒载载体3'羟羟基上，制造造出粘性末端，然后进行粘粘性末端连接接。4.人工工接头连接接头（linker）是是指人工合成成的一段双链寡核苷酸酸，其中包含一一个（或两个个）酶切位点。首先将接头头与目的DNA片段进行行平末端连接接，继而用适适当的内切酶酶将接头部位位切出粘性末末端，最后与与载体进行粘粘性末端连接接。（四）重组体导导入受体细胞胞在分子克隆中中，将质粒或以它为载体体构建的重组组分子导入受受体细胞的过过程称为转化（transformation）。以噬菌体和真核病毒作载体构建的的重组分子导导入受体细胞胞的过程称为为转染（transfection））。基因片段（特特别是纯化的的DNA）很很难直接导入入受体细胞，，通常将受体体细胞预先加加以处理，使使其提高基因因导入细胞的的效率。例如如用低温CaCl2（冰浴）处理理大肠杆菌，，可以大大提提高质粒的转转化效率。这这种经过预处处理的、容易导入外源源核酸分子的受体细细胞被称作“感受态细胞胞”（competentcell）。（五）重组体的的筛选通过转化、转转染等方式，，重组体DNA分子被导导入受体细胞胞，经适当涂涂布的培养基基培养得到大大量转化子菌菌落或转染噬噬菌斑。因为为每一重组体只携带某一段外源基基因，而转化或转转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分分子，所以设法将将众多的转化化菌落或噬菌菌斑区分开来来，并鉴定哪哪一菌落或噬噬菌斑所含的的重组DNA分子子确实带有有目的基因因，即可得得到目的的基因的的克隆，，这一过过程即为为筛选选（（screening））。根据据载载体体体体系系、、宿宿主主细细胞胞特特性性及及外外源源基基因因在在受受体体细细胞胞表表达达情情况况不不同同，，可可采采取取不不同同的的筛筛选选方方法法。。1.直接接筛筛选选法法（1））抗抗药药性性标标志志筛筛选选（2））标标志志补补救救（3））分分子子杂杂交交法法2.非非直直接接筛筛选选法法免疫疫学学方方法法抗药药性性标标志志筛筛选选如果果克克隆隆载载体体携携带带有有某某种种抗药药性性标标志志基基因因，如如Ampr或Tetr，转转化化后后只只有有含含这这种种抗抗药药基基因因的的转转化化子子细细菌菌才才能能在在含含该该抗抗生生素素的的培培养养板板上上生生存存并并形形成成菌菌落落，，这这样样就就可可将将转转化化菌菌与与非非转转化化菌菌区区别别开开来来。。如果果重重组组DNA时时将将外源源基基因因插插入入标标志志基基因因内内，如如插插入入Tetr内，，使使标标志志基基因因Tetr失活活，阳阳性性重重组组子子则则不不能能在在含含有有Tet的的培培养养板板上上生生长长。。用用插入入失失活活筛选选的的重重组组子子载载体体往往往往带带有有另一一个个抗抗生生素素抗抗性性基基因因如Ampr，因此此可以以通过过双抗生生素对照筛筛选，，即阳阳性转转化子子可以以在含含Amp的的培养养板上上生长长而不不能在在含Tet的培培养板板上生生长。。标志补补救若克隆隆的基基因能能够在在宿主主菌内内表达达，且且表达达产物物与宿宿主菌菌的营营养缺缺陷互互补，，则可可以利利用营养突突变菌菌株进行筛筛选，，这就就是标志补补救（（markerrescue））。-互互补：：通过蓝白斑斑筛选可可以筛筛选、、鉴定定重组组体与与非重重组体体载体体。当外源源基因因插入入后，，LacZ’基基因被被破坏坏，不不能合合成完完整的的β-半乳乳糖苷苷酶，，因此此不能能分解解底物物X-gal，，菌落落成白色β-半半乳糖糖苷酶酶能分分解X-gal，形形成蓝色菌落。。分子杂杂交法法（molecularhybridization）参见435页核酸分分子杂杂交（molecularhybridization））：指指用标标记的的已知知DNA或或RNA片片段（（探针）检测样样品中未未知核酸酸序列，，通过碱碱基互补补配对原原则发生生同源性性结合，，再经显显影或显显色的方方法，将将结合的的核酸序序列的位位置或大大小显示示出来。。探针：带有可可检测标标记的已已知序列列的DNA或RNA片片段。核酸分子杂交的基本原理变性（denaturation）复性（renaturation）杂交（hybridization）预杂交（prehybridization）变性（denaturation））概念：在某些些理化因因素的作作用下，，核酸双双链分子子碱基对对的氢键键断裂，，疏水作作用被破破坏，双双股螺旋旋或发夹夹结构打打开，有有规则的的结构被被破坏，，形成单单链分子子。变性的因因素：加热、、酸、碱碱、尿素素、甲酰酰胺等增色效应应（hyperchroniceffect）：：核酸变变性时，，紫外吸吸收值A260随之升高高的现象象。热变性DNA的的熔解曲曲线Tm值（meltingtemperature）:热变性性时，50%DNA分分子变性性的温度度。又叫叫解链温温度、熔熔解温度度。复性（renaturation））概念：在适当当条件下下，变性性DNA的两条条互补单单链重新新缔合，，形成双双链的过过程。热变性后后，缓慢降低低温度至比Tm值低20-30℃时，变性性的单链链DNA可恢复复其双链链结构，，称为退火。杂交（hybridization）来源不不同的两条条单链核酸分分子通通过碱碱基互互补可可形成成异源源双螺螺旋。。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交交分子子。预杂交交（prehybridization））概念：为了了减少少探针针与广广泛存存在的的非互互补核核酸的的非特特异性性结合合，在在杂交交前用用封闭闭物将将这些些非特特异性性位点点封闭闭。这这一杂杂交前前的处处理过过程称称为预预杂交交。常用的的封闭闭物：变性性的非非特异异性DNA，如如鲑鱼鱼精子子DNA、、小牛牛胸腺腺DNA，，又称称为覆覆盖DNA。变性、复性、、杂交示意图图核酸探针：带有可检测测标记的已知知DNA或RNA片段，，用于检测待待测样品中的的靶核酸序列列。探针分类放射性标记核酸探针非放射性标记核酸探针印迹杂交概念：指将待测核核酸序列结合合到一定的支支持物上，然然后与存在于于液相中的核核酸探针进行行杂交的过程程。探针与待测测核酸片段段中的同源源序列形成成杂交分子子，探针分分子显示的的位置及其其量的多少少可反应出出待测的核核酸分子是是否存在相相应的基因因序列及其其大小。

分类DNA印迹杂交（Southernblotting）RNA印迹杂交（Northernblotting）提取DNA限制性内切切酶消化琼脂糖凝胶胶电泳碱变性转移到NC膜与DNA或或RNA探探针杂交放射自显影影DNA印迹迹杂交（Southernblotting）检测靶分子子为DNA,检测测靶分子是是否含有目目的基因将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移移到硝酸纤维素素膜上菌落原位杂杂交（Insituhybridization））含有与探针针互补序列列的菌落或或噬菌斑经经放射自显显影后，在在X光底片片上出现杂杂交点。将转化后得得到的菌落落或噬菌斑斑原位转移移到NC膜膜上，得到到一个与平平板菌落或或噬菌斑分分布完全一一致的复制制品。原位裂解细细胞，碱变变性，核酸酸分子被固固定于膜上上加入标记的的DNA或或RNA探探针进行杂交根据阳性反反应位置，，可从保留留的母板上上挑出所需需的阳性克隆。RNA印迹杂交（（Northernblotting）检测靶分子子为RNA。主要用用于检测某某一组织或或细胞中已已知的特异异mRNA的表达水水平，或比比较不同组组织或细胞胞的同一基基因的表达达情况。与Southernblotting不同的的是在转移移前不需进进行限制性性内切酶切切割。核酸杂交分分类表杂交方法适用范围Southern印迹检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上Northern印迹检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上斑点杂交检测未经分离的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑杂交检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释放出的DNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子免疫学方法法免疫学筛选选是利用特特异抗体与目的基因因表达的抗原产物相互作作用进行筛筛选，特异异性和敏感感性也较高高，尤其适适用于筛选选不为宿主主菌提供任任何选择标标记的基因因，或者是是已获得了了该基因编编码的蛋白白质产物的的多克隆或或单克隆抗抗体，用这这些抗体来来检测目的的基因表达达的产物。。免疫学方方法很多，，如Westernblot，免免疫疫化化学学方方法法、、酶酶联联免免疫疫吸吸附附剂剂测测定定（（enzymelinkedimmunosorbentassay，，ELISA））、、放放射射免免疫疫沉沉淀淀、、免免疫疫荧荧光光抗抗体体技技术术等等，，可可对目目的的基基因因表表达达的的蛋蛋白白进进行行定定性性，，甚甚至至定定量量检检测测。基因因工工程程的的最最终终目目的的是是在在一一个个合适适的的系系统统中，，使使外源源基基因因高高效效表表达达，从从而而产产生生有有重重要要价价值值的的蛋白白质质产品品。。其过过程程包包括括外外源源