7酶分子的化学修饰课件

第七章酶分子的化学修饰第七章酶分子的化学修饰1

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。

但是酶在实际应用中有局限性：1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解；2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活；3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂2改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。蛋白质水平2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。核酸水平改变酶特性有两种主要的方法：3化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。

化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。第一节酶的化学修饰

（一级结构水平的改造）

（原理、方法、应用）

化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修4

一、化学修饰原理凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联），都可称为蛋白质的化学修饰。达到：改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）一、化学修饰原理凡通过化学基团的引入或5化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－谷氨酰胺酶、L－天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其61、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性

修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性73、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶84、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。4、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境95、改变酶学性质绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没改变，但有些酶修饰后米氏常数会增大。原因可能是交联于酶上的大分子修饰剂产生的空间障碍影响了底物对酶的接近和结合，但同时由于修饰酶稳定性增强和半衰期延长，可弥补Km值增大的缺陷。5、改变酶学性质10二、化学修饰分类（一）金属离子置换修饰（二）大分子结合修饰（三）肽链有限水解修饰（四）酶蛋白侧链基团修饰（五）亲和修饰（六）氨基酸置换修饰二、化学修饰分类（一）金属离子置换修饰11（一）金属离子置换修饰1、概念2、作用范围3、常用金属离子4、方法步骤（一）金属离子置换修饰1、概念121、概念通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。1、概念通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改132、作用范围含有金属离子的酶金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。2、作用范围含有金属离子的酶143、常用金属离子（往往是二价离子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。3、常用金属离子154、方法步骤向酶液加入一定量的EDTA－将酶与金属鳌合物分离－金属离子置换。4、方法步骤16５、举例淀粉酶：一般的α-淀粉酶是多离子型的，含Ca2+、Mg2+、Zn2+等若把其它的离子都换为钙离子，活力及稳定性均提高。所以淀粉酶的生产、保存和应用中可添加一定量的钙离子。将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。５、举例17（二）大分子结合修饰1、概念2、通常使用的水溶性大分子修饰剂3、修饰方法4、大分子修饰后酶性质的变化（二）大分子结合修饰1、概念181、概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。1、概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的192、通常使用的水溶性大分子修饰剂聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。2、通常使用的水溶性大分子修饰剂20聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性213、修饰方法修饰剂活化－与酶分子结合－对酶分子进行修饰3、修饰方法修饰剂活化－与酶分子结合－对酶分子进行修饰224、大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）增加酶的稳定性半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。（2）降低抗原抗体反应1.抗原2.抗体免疫抗原性抗原性反应抗原性4、大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力23例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍5.实例例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗24（三）肽链有限水解修饰1、概念2、修饰后酶性质的变化3、修饰剂（三）肽链有限水解修饰1、概念251、概念利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。1、概念26酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1

引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：272、修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）降低或消除抗原性2、修饰后酶性质的变化283、修饰剂专一性较强的蛋白酶或肽酶3、修饰剂294.实例酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

4.实例酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶307酶分子的化学修饰课件31b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活327酶分子的化学修饰课件33（四）酶分子的侧链基团修饰1.定义采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。（四）酶分子的侧链基团修饰1.定义34可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功35（1）羧基修饰剂可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物称为羧基修饰剂。修饰剂:碳化二亚胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸等（1）羧基修饰剂可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物36常见基团的化学修饰反应（酰胺化）：羧基见292页常见基团的化学修饰反应（酰胺化）：羧基见292页37（2）氨基修饰剂凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物称为氨基修饰剂。修饰剂:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：赖氨酸等（2）氨基修饰剂凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物称为38常见基团的化学修饰反应（甲基化与乙酰化）：氨基常见基团的化学修饰反应（甲基化与乙酰化）：氨基39（3）巯基修饰剂两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯基具有很强的亲核性，巯基一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐等（3）巯基修饰剂两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯40常见基团的化学修饰反应（烷基化）：巯基常见基团的化学修饰反应（烷基化）：巯基41（4）酚羟基修饰剂蛋白质的酪氨酸残基上含有酚羟基。修饰方法：碘化法、硝化法等修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。（4）酚羟基修饰剂蛋白质的酪氨酸残基上含有酚羟基。42常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基43（5）胍基修饰剂精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰，而一些二羰基化合物能够在中性或弱碱性条件下与精氨酸反应，目前关于精氨酸的修饰的研究主要集中在二羰基化合物上。（5）胍基修饰剂精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰，44常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基45指修饰剂与底物相类似的结构，对酶活性部位具有特异的亲和性，只对活性部位的氨基酸残基进行共价修饰的方法，也称位点专一性修饰。作用原理与专一性不可逆抑制剂相同。

(五)亲和修饰指修饰剂与底物相类似的结构，对酶活性部位具有特异的亲和性，只46(六)氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。

通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：定点突变技术。(六)氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸47例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。

例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性48定点突变技术（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。定点突变技术（sitedirectedmutagenes49酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析酶分子的定点突变1、基因序列分析50三、酶化学修饰的应用

在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。

在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。三、酶化学修饰的应用在医药方面：化学修饰可以提高医用51四、酶蛋白化学修饰的局限性1.扩散速度受限2.生物活性降低3.修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高，修饰后的酶分子相对分子质量分布宽、稳定性不够理想等四、酶蛋白化学修饰的局限性1.扩散速度受限52第二节酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。第二节酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大53半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，54表6-1天然酶和修饰酶的热稳定性比较

酶

修饰剂

修饰酶

天然酶

处理条件(℃/时间)

残留酶活(%)酰苷脱氢酶

胰蛋白酶

过氧化氢酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50表6-1天然酶和修饰酶的热稳定性比较酶修饰剂修饰酶55酶L-Asn酶SOD酶

Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脱氢酶Arg酶过氧化氢酶胰蛋白酶抗原性修饰剂-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除表6-2修饰酶的抗原性变化酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脱氢酶56表6-3天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶抗抑制剂抗蛋白酶修饰剂抗失活剂过氧化氢酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂——抗尿素抗SDS表6-3天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶抗抑制剂抗蛋白酶57表6-4天然酶与修饰酶的半衰期比较酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶修饰剂半衰期天然酶修饰酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h表6-4天然酶与修饰酶的半衰期比较酶羧肽酶Arg酶Gln58表6-5天然酶与修饰酶的最适pH酶修饰酶天然酶修饰剂糜蛋白酶猪肝尿酸酶吲哚-3-链烷羟化酶猪肝尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0表6-5天然酶与修饰酶的最适pH酶修饰酶天然酶修饰剂糜蛋白59第三节变性、诱导与构象重建

（对酶高级结构调整）

酶肽链变性松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下复性，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理第三节变性、诱导与构象重建

（对酶高60酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是61再见！再见！62第七章酶分子的化学修饰第七章酶分子的化学修饰63

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。

但是酶在实际应用中有局限性：1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解；2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活；3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂64改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。蛋白质水平2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。核酸水平改变酶特性有两种主要的方法：65化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。

化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。第一节酶的化学修饰

（一级结构水平的改造）

（原理、方法、应用）

化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修66

一、化学修饰原理凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联），都可称为蛋白质的化学修饰。达到：改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）一、化学修饰原理凡通过化学基团的引入或67化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－谷氨酰胺酶、L－天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其681、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性

修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性693、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶704、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。4、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境715、改变酶学性质绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没改变，但有些酶修饰后米氏常数会增大。原因可能是交联于酶上的大分子修饰剂产生的空间障碍影响了底物对酶的接近和结合，但同时由于修饰酶稳定性增强和半衰期延长，可弥补Km值增大的缺陷。5、改变酶学性质72二、化学修饰分类（一）金属离子置换修饰（二）大分子结合修饰（三）肽链有限水解修饰（四）酶蛋白侧链基团修饰（五）亲和修饰（六）氨基酸置换修饰二、化学修饰分类（一）金属离子置换修饰73（一）金属离子置换修饰1、概念2、作用范围3、常用金属离子4、方法步骤（一）金属离子置换修饰1、概念741、概念通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。1、概念通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改752、作用范围含有金属离子的酶金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。2、作用范围含有金属离子的酶763、常用金属离子（往往是二价离子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。3、常用金属离子774、方法步骤向酶液加入一定量的EDTA－将酶与金属鳌合物分离－金属离子置换。4、方法步骤78５、举例淀粉酶：一般的α-淀粉酶是多离子型的，含Ca2+、Mg2+、Zn2+等若把其它的离子都换为钙离子，活力及稳定性均提高。所以淀粉酶的生产、保存和应用中可添加一定量的钙离子。将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。５、举例79（二）大分子结合修饰1、概念2、通常使用的水溶性大分子修饰剂3、修饰方法4、大分子修饰后酶性质的变化（二）大分子结合修饰1、概念801、概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。1、概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的812、通常使用的水溶性大分子修饰剂聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。2、通常使用的水溶性大分子修饰剂82聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性833、修饰方法修饰剂活化－与酶分子结合－对酶分子进行修饰3、修饰方法修饰剂活化－与酶分子结合－对酶分子进行修饰844、大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）增加酶的稳定性半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。（2）降低抗原抗体反应1.抗原2.抗体免疫抗原性抗原性反应抗原性4、大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力85例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍5.实例例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗86（三）肽链有限水解修饰1、概念2、修饰后酶性质的变化3、修饰剂（三）肽链有限水解修饰1、概念871、概念利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。1、概念88酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1

引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：892、修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）降低或消除抗原性2、修饰后酶性质的变化903、修饰剂专一性较强的蛋白酶或肽酶3、修饰剂914.实例酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

4.实例酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶927酶分子的化学修饰课件93b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活947酶分子的化学修饰课件95（四）酶分子的侧链基团修饰1.定义采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。（四）酶分子的侧链基团修饰1.定义96可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功97（1）羧基修饰剂可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物称为羧基修饰剂。修饰剂:碳化二亚胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸等（1）羧基修饰剂可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物98常见基团的化学修饰反应（酰胺化）：羧基见292页常见基团的化学修饰反应（酰胺化）：羧基见292页99（2）氨基修饰剂凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物称为氨基修饰剂。修饰剂:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：赖氨酸等（2）氨基修饰剂凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物称为100常见基团的化学修饰反应（甲基化与乙酰化）：氨基常见基团的化学修饰反应（甲基化与乙酰化）：氨基101（3）巯基修饰剂两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯基具有很强的亲核性，巯基一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐等（3）巯基修饰剂两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯102常见基团的化学修饰反应（烷基化）：巯基常见基团的化学修饰反应（烷基化）：巯基103（4）酚羟基修饰剂蛋白质的酪氨酸残基上含有酚羟基。修饰方法：碘化法、硝化法等修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。（4）酚羟基修饰剂蛋白质的酪氨酸残基上含有酚羟基。104常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基105（5）胍基修饰剂精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰，而一些二羰基化合物能够在中性或弱碱性条件下与精氨酸反应，目前关于精氨酸的修饰的研究主要集中在二羰基化合物上。（5）胍基修饰剂精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰，106常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基107指修饰剂与底物相类似的结构，对酶活性部位具有特异的亲和性，只对活性部位的氨基酸残基进行共价修饰的方法，也称位点专一性修饰。作用原理与专一性不可逆抑制剂相同。

(五)亲和修饰指修饰剂与底物相类似的结构，对酶活性部位具有特异的亲和性，只108(六)氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。

通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：定点突变技术。(六)氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸109例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。

例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性110定点突变技术（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。定点突变技术（sitedirectedmutagenes111酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析酶分子的定点突变1、基因序列分析112三、酶化学修饰的应用

在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。

在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。三、酶化学修饰的应用在医药方面：化学修饰可以提高医用113四、酶蛋白化学修饰的局限性1.扩散速度受限2.生物活性降低3.修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高，修饰后的酶分子相对分子质量分布宽、稳定性不够理想等四、酶蛋白化学修饰的局限性1.扩散速度受限114第二节酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。第二节酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大115半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、