蛋白相互作用酵母双杂交课件

蛋白相互作用与酵母双杂交Protein-proteinInteraction&YeastTwo-hybrid黄宝玉2012.8.17Slide1蛋白相互作用与酵母双杂交Slide11报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide2报告内容：Slide22Protein-proteinInteraction蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。Slide3Protein-proteinInteraction蛋白质3蛋白质相互作用研究技术Genetic

YeastTwo-hybridPhageDisplayMutationalanalysisBiochemicalImmunoprecipitation(IP)Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Pull-DownAssaysFarWesternChemicalCrosslinkingLabel-transferFeBABEmappingFluorescentImmunofluorescence

co-localizationFRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)Slide4蛋白质相互作用研究技术GeneticChemicalSli4Slide5Slide55噬菌体展示技术的原理融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。Slide6噬菌体展示技术的原理融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体展示技6biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigenSlide7biotinantigenSolutionphases7BindtoStreptavidincoatedmicrotitrewellsSlide8BindtoStreptavidincoatedmic8Washtoremoveunboundphageparticles.Slide9Washtoremoveunboundphagep9EluteboundphageSlide10EluteboundphageSlide1010AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和扩增Slide11AmplifyelutedphageE.coli感染Sl11Slide12Slide1212Slide13Slide1313RIGIExperimental

Control(GST-Fusion)

(GST)

GSTMAVSGSTGSTMAVSGSTWashSDSGST沉降示意图GST-pulldown原理RIGIRIGISlide14RIGIExperimental14Cross-linkingSlide15Cross-linkingSlide1515报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide16报告内容：Slide1616酵母双杂交系统的功能Slide17酵母双杂交系统的功能Slide1717酵母双杂交原理图酵母双杂交的简单介绍Slide18酵母双杂交原理图酵母双杂交的简单介绍Slide1818酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoter

reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterreportergeneGAL4UASPromoter

reportergeneXDNA-BDSlide19(Fields&Song,1989)酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UA19酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因Slide20酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因Slide2020三个启动子，四个报告基因HIS3.Whenbaitandpreyproteinsinteract,Gal4-responsiveHis3expressionpermitsthecelltobiosynthesizehistidineandgrowon–Hisminimalmedium.ADE2.Whentwoproteinsinteract,Ade2expressionisactivated,allowingthesecellstogrowon–Ademinimalmedium.AUR1-C.AdominantmutantversionoftheAUR1genethatencodestheenzymeinositolphosphorylceramidesynthase.itsexpressionconfersstrongresistance(AbAr)totheotherwisehighlytoxicdrugAureobasidinA.MEL1.MEL-1encodesα-galactosidase.Asaresultoftwo-hybridinteractions,α-galactosidase(MEL1)isexpressedandsecretedbytheyeastcells.YeastcoloniesthatexpressMel1turnblueinthepresenceofthechromagenicsubstrateX-a-Gal.Slide21三个启动子，四个报告基因HIS3.Whenbaitan21酵母双杂交所用的两个质粒载体Slide22酵母双杂交所用的两个质粒载体Slide2222RestrictionMapandMultipleCloningSite(MCS)ofpGBKT7Slide23RestrictionMapandSlide2323RestrictionMapand

MultipleCloningSite(MCS)ofpGADT7.Slide24RestrictionMapandSlide2424基因序列克隆融合酶融合转化大肠杆菌感受态并测序酵母质粒双酶切线性化

涂布二缺培养基测序正确的质粒转化酵母涂板单缺培养基挑选发育良好菌落mating利用酵母双杂验证两蛋白相互作用实验流程涂布四缺培养基Slide25基因序列克隆融合酶融合转化大肠杆菌感受态并测序酵母质粒双酶25基因序列克隆AmplifyyourbaitinsertbyPCRusingoligosthatcontaina24bphomologytoyourbait,anda15bphomologytothelinearendsofpGBKT7,whicharedesignedasfollows:ForwardPrimer(111=firstcodonofyourbait)5’-CATGGAGGCCGAATTC111222333444555666777888ReversePrimer(LLL=reversecomplementoflastcodonofyourbait)5’-GCAGGTCGACGGATCC

LLLNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNOTE:Theseprimersactuallycontain16bpofhomologyinordertokeeptheBamHIandEcoRIsitesintactSlide26基因序列克隆Amplifyyourbait26酵母质粒双酶切线性化10×NEBbuffer1ul100×BSA0.1ulEcoRI0.2ul37℃，3hBamHI0.2ulpGBKT78.5ulSlide27酵母质粒双酶切线性化10×NEBbuffer127融合酶融合5×In-FusionHDEnzymePremix2ulLinearizedVector(50-200ng)xulPurifiedPCRFragment(10-200ng)xul50℃，15min。dH2OxulThenplaceonice.10ulSlide28融合酶融合5×In-FusionHDEnzymePre28转化大肠杆菌感受态并测序重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞挑阳性克隆进行菌落pcr送测序测序正确提取质粒Slide29转化大肠杆菌感受态并测序重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞挑阳性29测序正确的质粒转化酵母

1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30℃培养3天左

右。2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mlYPDA的玻璃试管中（平行做3管）30℃，250rpm，培养8-12h3.取200ul菌液，测OD600。4.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50ml新鲜的YPDA培养基中30℃，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3。5.将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。6.30℃，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）。7.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30mlddH2O重悬。8.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.5ml1.1×TE/LiAc重悬。9.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s。10.弃上清，每管用600ul1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。酵母菌株感受态细胞制备：Slide30测序正确的质粒转化酵母1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在30TransformationofCompetentYeastCells:1.加入质粒DNA100-500ng

鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml) 5ul

加入感受态细胞,轻弹混匀

50ul

加入PEG/LiAc,轻弹混匀

500ul2.30℃水浴，每10轻弹混匀

30min3.加入DMSO,轻弹混匀

20ul

4.42℃水浴，每5min轻弹混匀

15min

5.离心，弃上清，10000rpm

15s

6.用0.9%NaCl重悬 1ml7取适量菌液涂布在相应的筛选培养基上。测序正确的质粒转化酵母我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。PEG是一种高分子聚合物,在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过度损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。DMSO增加细胞通透性以增加转化效率。

鲑鱼精carrierDNA为短的线形单链DNA,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精carrierDNA在转化实验体系中以单链形式存在。Slide31TransformationofCompetentYe31涂布单缺培养基pGADT7Amp+-LeupGBKT7Kan+-TrpSlide32涂布单缺培养基pGADT7Amp+-LeuSlid32挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺培养基筛选Slide33挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺培养基筛选Slid33

一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的BD单独与UAS结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的自激活现象。酵母双杂交系统的自激活验证Slide34一般情况下，单独的BD可以与GAL434TranscriptionfactorsGAL4BD原理：Slide35TranscriptionfactorsGAL4BD原理：35Youshoulddemonstratethatyourbaitproteinisnottoxicwhenexpressedinyeast.Ifyourbaitistoxictotheyeastcells,bothsolidandliquidcultureswillgrowmoreslowly.Ifexpressionofyourbaitproteindoeshavetoxiceffects,youmaywishtoswitchtoavector(suchaspGBT9)thathasalowerlevelofexpression.1.Materials:•Y2HGoldcompetentcell•SD/–Trpagarplates•SD/–Trpbroth2.Transform100ngofthefollowingvectors:•pGBKT7(empty)•pGBKT7+clonedbaitgene3.Spread100μlof1/10and1/100dilutionsofyourtransformationmixturesontoSD/–Trp.4.Growat30°Cfor3–5days:Note:Ifyourbaitistoxic,youmaynoticethatcoloniescontainingyourbaitvectoraresignificantlysmallerthancoloniescontainingtheemptypGBKT7vector.酵母双杂交的毒性验证：Slide36Youshoulddemonstratethatyo36报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide37报告内容：Slide3737Slide38Slide3838(一)酵母单杂交系统(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处Slide39(一)酵母单杂交系统(one-hybridsystem39酵母单杂交系统原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。Slide40酵母单杂交系统原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系40(二)反向酵母双杂交系统

(reverse

yeasttwo-hybridsystem)1996年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.Slide41(二)反向酵母双杂交系统

(reverseyeast41(二)反向酵母双杂交系统

（reverse

yeasttwo-hybridsystem）该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选。在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。Slide42(二)反向酵母双杂交系统

（reverseyeast42

反向双杂交系统基本原理示意图Slide43反向双杂交系统基本原理示意图Slide4343报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide44报告内容：Slide4444GAL4-BDbaitvectorGAL4-ADprayvectorpGBKT7pGBKT7-53pGBKT7-lampGADT7pGADT7-TpGADT7SD/-Trp/-LeuSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal+AbApGADT7-T已有实验进展展Slide45

45GAL4-ADprayvectorGAL4-BDbaitvectorRIGI-1pGADT7RIGI-1-ΔpGADT7RIGI-8pGADT7RIGI-8-ΔpGADT7MAVSpGADT7pGBKT7pGBKT7-MAVSpGBKT7pGBKT7-MAVSSD/-Trp/-LeuSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal+AbATRAF6pGADT7Slide46

46GAL4-ADprayvectorGAL4-BDbaitvectorpGADT7CAS8-3pGADT7CAS8-4pGADT7pGBKT7pGBKT7-FADDpGBKT7SD/-Trp/-LeuSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal+AbApGBKT7-FADD已有实验进展Slide47

47Slide48BD+Cg-cas8mBD+ADFADD+Cg-cas8mFADD+ADSD/-Trp/-LeuSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal+AbA已有实验进展BD+Cg-cas8mBD+ADFADD+Cg-cas8mFADD+ADSlide48BD+Cg-cas8mFADD+Cg-cas48报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide49报告内容：Slide4949存在问题与下一步计划RIGI-MAVS酵母双杂交显示无相互作用。进行下一步酵母文库构建已筛选与RIGI或MAVS相互作用的蛋白，后续pull-down，CO-ip验证。通过FADD-Caspase8相互作用的pull-down，CO-ip验证熟悉整个蛋白互作验证的整个实验流程。Slide50存在问题与下一步计划RIGI-MAVS酵母双杂交显示无50Thanksforyourattention！Thanksforyourattention！5152可编辑感谢下载52可编辑感谢下载蛋白相互作用与酵母双杂交Protein-proteinInteraction&YeastTwo-hybrid黄宝玉2012.8.17Slide53蛋白相互作用与酵母双杂交Slide153报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide54报告内容：Slide254Protein-proteinInteraction蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。Slide55Protein-proteinInteraction蛋白质55蛋白质相互作用研究技术Genetic

YeastTwo-hybridPhageDisplayMutationalanalysisBiochemicalImmunoprecipitation(IP)Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Pull-DownAssaysFarWesternChemicalCrosslinkingLabel-transferFeBABEmappingFluorescentImmunofluorescence

co-localizationFRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)Slide56蛋白质相互作用研究技术GeneticChemicalSli56Slide57Slide557噬菌体展示技术的原理融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。Slide58噬菌体展示技术的原理融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体展示技58biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigenSlide59biotinantigenSolutionphases59BindtoStreptavidincoatedmicrotitrewellsSlide60BindtoStreptavidincoatedmic60Washtoremoveunboundphageparticles.Slide61Washtoremoveunboundphagep61EluteboundphageSlide62EluteboundphageSlide1062AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和扩增Slide63AmplifyelutedphageE.coli感染Sl63Slide64Slide1264Slide65Slide1365RIGIExperimental

Control(GST-Fusion)

(GST)

GSTMAVSGSTGSTMAVSGSTWashSDSGST沉降示意图GST-pulldown原理RIGIRIGISlide66RIGIExperimental66Cross-linkingSlide67Cross-linkingSlide1567报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide68报告内容：Slide1668酵母双杂交系统的功能Slide69酵母双杂交系统的功能Slide1769酵母双杂交原理图酵母双杂交的简单介绍Slide70酵母双杂交原理图酵母双杂交的简单介绍Slide1870酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoter

reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterreportergeneGAL4UASPromoter

reportergeneXDNA-BDSlide71(Fields&Song,1989)酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UA71酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因Slide72酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因Slide2072三个启动子，四个报告基因HIS3.Whenbaitandpreyproteinsinteract,Gal4-responsiveHis3expressionpermitsthecelltobiosynthesizehistidineandgrowon–Hisminimalmedium.ADE2.Whentwoproteinsinteract,Ade2expressionisactivated,allowingthesecellstogrowon–Ademinimalmedium.AUR1-C.AdominantmutantversionoftheAUR1genethatencodestheenzymeinositolphosphorylceramidesynthase.itsexpressionconfersstrongresistance(AbAr)totheotherwisehighlytoxicdrugAureobasidinA.MEL1.MEL-1encodesα-galactosidase.Asaresultoftwo-hybridinteractions,α-galactosidase(MEL1)isexpressedandsecretedbytheyeastcells.YeastcoloniesthatexpressMel1turnblueinthepresenceofthechromagenicsubstrateX-a-Gal.Slide73三个启动子，四个报告基因HIS3.Whenbaitan73酵母双杂交所用的两个质粒载体Slide74酵母双杂交所用的两个质粒载体Slide2274RestrictionMapandMultipleCloningSite(MCS)ofpGBKT7Slide75RestrictionMapandSlide2375RestrictionMapand

MultipleCloningSite(MCS)ofpGADT7.Slide76RestrictionMapandSlide2476基因序列克隆融合酶融合转化大肠杆菌感受态并测序酵母质粒双酶切线性化

涂布二缺培养基测序正确的质粒转化酵母涂板单缺培养基挑选发育良好菌落mating利用酵母双杂验证两蛋白相互作用实验流程涂布四缺培养基Slide77基因序列克隆融合酶融合转化大肠杆菌感受态并测序酵母质粒双酶77基因序列克隆AmplifyyourbaitinsertbyPCRusingoligosthatcontaina24bphomologytoyourbait,anda15bphomologytothelinearendsofpGBKT7,whicharedesignedasfollows:ForwardPrimer(111=firstcodonofyourbait)5’-CATGGAGGCCGAATTC111222333444555666777888ReversePrimer(LLL=reversecomplementoflastcodonofyourbait)5’-GCAGGTCGACGGATCC

LLLNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNOTE:Theseprimersactuallycontain16bpofhomologyinordertokeeptheBamHIandEcoRIsitesintactSlide78基因序列克隆Amplifyyourbait78酵母质粒双酶切线性化10×NEBbuffer1ul100×BSA0.1ulEcoRI0.2ul37℃，3hBamHI0.2ulpGBKT78.5ulSlide79酵母质粒双酶切线性化10×NEBbuffer179融合酶融合5×In-FusionHDEnzymePremix2ulLinearizedVector(50-200ng)xulPurifiedPCRFragment(10-200ng)xul50℃，15min。dH2OxulThenplaceonice.10ulSlide80融合酶融合5×In-FusionHDEnzymePre80转化大肠杆菌感受态并测序重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞挑阳性克隆进行菌落pcr送测序测序正确提取质粒Slide81转化大肠杆菌感受态并测序重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞挑阳性81测序正确的质粒转化酵母

1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30℃培养3天左

右。2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mlYPDA的玻璃试管中（平行做3管）30℃，250rpm，培养8-12h3.取200ul菌液，测OD600。4.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50ml新鲜的YPDA培养基中30℃，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3。5.将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。6.30℃，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）。7.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30mlddH2O重悬。8.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.5ml1.1×TE/LiAc重悬。9.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s。10.弃上清，每管用600ul1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。酵母菌株感受态细胞制备：Slide82测序正确的质粒转化酵母1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在82TransformationofCompetentYeastCells:1.加入质粒DNA100-500ng

鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml) 5ul

加入感受态细胞,轻弹混匀

50ul

加入PEG/LiAc,轻弹混匀

500ul2.30℃水浴，每10轻弹混匀

30min3.加入DMSO,轻弹混匀

20ul

4.42℃水浴，每5min轻弹混匀

15min

5.离心，弃上清，10000rpm

15s

6.用0.9%NaCl重悬 1ml7取适量菌液涂布在相应的筛选培养基上。测序正确的质粒转化酵母我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。PEG是一种高分子聚合物,在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过度损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。DMSO增加细胞通透性以增加转化效率。

鲑鱼精carrierDNA为短的线形单链DNA,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精carrierDNA在转化实验体系中以单链形式存在。Slide83TransformationofCompetentYe83涂布单缺培养基pGADT7Amp+-LeupGBKT7Kan+-TrpSlide84涂布单缺培养基pGADT7Amp+-LeuSlid84挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺培养基筛选Slide85挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺培养基筛选Slid85

一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的BD单独与UAS结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的自激活现象。酵母双杂交系统的自激活验证Slide86一般情况下，单独的BD可以与GAL486TranscriptionfactorsGAL4BD原理：Slide87TranscriptionfactorsGAL4BD原理：87Youshoulddemonstratethatyourbaitproteinisnottoxicwhenexpressedinyeast.Ifyourbaitistoxictotheyeastcells,bothsolidandliquidcultureswillgrowmoreslowly.Ifexpressionofyourbaitproteindoeshavetoxiceffects,youmaywishtoswitchtoavector(suchaspGBT9)thathasalowerlevelofexpression.1.Materials:•Y2HGoldcompetentcell•SD/–Trpagarplates•SD/–Trpbroth2.Transform100ngofthefollowingvectors:•pGBKT7(empty)•pGBKT7+clonedbaitgene3.Spread100μlof1/10and1/100dilutionsofyourtransformationmixturesontoSD/–Trp.4.Growat30°Cfor3–5days:Note:Ifyourbaitistoxic,youmaynoticethatcoloniescontainingyourbaitvectoraresignificantlysmallerthancoloniescontainingtheemptypGBKT7vector.酵母双杂交的毒性验证：Slide88Youshoulddemonstratethatyo88报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide89报告内容：Slide3789Slide90Slide3890(一)酵母单杂交系统(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处Slide91(一)酵母单杂交系统(one-hybridsystem91酵母单杂交系统原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。Slide92酵母单杂交系统原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系92(二)反向酵母双杂交系统

(reverse

yeasttwo-hybridsystem)1996年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,B