羟基喜树碱中华文章题库VIP

10-羟基喜树碱对CIA 的免疫调节作用王燕1黄贺梅2胡晓舟1胡慧华11郑州大学第五附属医院风湿免疫科 450052 主任医师Email:wangyanh_1963@163.com2郑州铁路职业技术学院医学技术系 450052通讯作者:胡慧华,Email:hhhu@尊敬的编辑部负责同志：《10-羟基喜树碱对类风湿关节炎患者T淋巴细胞抑制作用研究》获得2011年河南省科技厅计划项目基金10万元，为河南省重点科技攻关项目。属于省部级立项课题论文。项目编号 112102310610项目第一负责人：王燕[摘要]目的 探讨10-羟基喜树碱对小鼠胶原诱导性关节炎 （CIA）的免疫调节作用。方法 通过10-羟基喜树碱干预 CIA 模型，观察小鼠发病情况，运用免疫组化技术观察局部关节病变程度；FACs分析T细胞亚群变化； ELISA 检测细胞培养上清中 TGF-β、IFN-γ、IL-17 水平,检测Treg、Th1、Th17细胞相关转录因子表达水平。结果经过10-羟基喜树碱干预，小鼠自身反应性T细胞的增殖能力被显著抑制。与CIA组比较，10-羟基喜树碱组Treg细胞百分比上升，Th1、Th17细胞百分比明显降低；各细胞分泌细胞因子的能力也发生相应的变化，其中TGF-β上升，IFN-γ、IL-17降低；Treg细胞转录因子Foxp3基因水平提高。结论10-羟基喜树碱可通过抑制CIA小鼠自身反应性T细胞增殖，上调小鼠体内Treg细胞并抑制Th1、Th17细胞的表达而发挥免疫调节作用，有效降低小鼠发病严重度和关节炎症。[关键词] 10-羟基喜树碱；CIA；Treg；Th1；Th17Immunoregulatory rolesofHCPT incollageninducedarthritis

WANG Yan,HU Xiaozhou,HUHuihua.TheFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,DivisionofRheumatology.450052,China.HUANGHemei.ZhengzhouRailwayVocationalandTechnicalCollegeofMedicalTechnology.450052,China.HUANGHemei,Correspondingauthor: HUHuihua,Email:hhhu@[Abstract] ThestudyaimstoexploretheimmunoregulatoryrolesofHCPToncollagen-inducedarthritis. DBA/1 miceweretreatedwithHCPT,andthenusedtoestablishcollageninducedarthritis (CIA).After diseaseonset,theincidence, severity, andjoint histopathology wereevaluated.WedetectedthepercentageofThsubsetssuchasTreg,Th1andTh17.ELISAassaywasusedtodetectthelevelsofrelatedcytokinesintheculturesupernatants.MiceintheHCPT-treatedgroupshowedalleviateddiseasesymptoms,andlessinfiltrationofinflammatorycellsinthejointsections.Theproliferation ofCII-specific cellswasinhibited intheHCPTtreatmentgroup.HCPTtreatmentalsoincreasedthepercentageofTregcells,butdecreasedthepercentageofTh1andTh17.TheresultsofthisstudyindicatedthatHCPTtreatmentcanreducetheincidenceandseverityofCIAbyup-regulatingTreganddown-regulatingTh1andTh17.[Keywords]HCPT;CIA;Treg;Th1;Th17类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以对称性多关节炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。持续的滑膜炎可导致关节内软骨和骨的破坏，导致关节功能受限。目前虽然针对RA的治疗方法较多，如采用免疫抑制剂、激素、细胞因子拮抗剂、阻断T-B细胞接触的信号途径等[1-3]，但疗效并不理想，且副作用大，如部分患者出现肝肾毒性或骨髓抑制等。因此，寻找疗效好、副作用少的新型治疗药物一直是类风湿关节炎治疗领域的热门话题。10-羟基喜树碱（HCPT）具有较强的抗肿瘤作用，从抑制细胞增殖的角度分析，该药物可以通过抑制淋巴细胞活性，进而抑制机体的异常免疫反应，因此，该药物从理论上能够起到控制RA疾病发展的作用。本研究采用CIA动物模型对HCPT的免疫调节作用进行了初步探讨。为了研究HCPT在CIA发病中的免疫调节机制，我们观察了HCPT干预后，CIA小鼠关节发病情况、自身反应性T细胞的增殖能力、以及发病不同时期T细胞亚群及相关因子的表达水平，为今后 HCPT应用于RA的预防治疗提供更多的理论及实验依据。材料与方法1.1实验动物：购买 30只DBA/1 小鼠（雄性， 6～8周）。1.2主要试剂和仪器：鸡源性 II型胶原蛋白（ typeIIcollagen，fromchicksternacartilage，纯度＞99%）购于Chondrex公司；MouseELISAKit（IFN-γ、IL-17、TGF-β）购自于eBioscience公司；Westernblot实验抗体均购自于 Cellsignaling 公司；不完全弗氏佐剂（ IFA）和热灭活结核分枝杆菌（TB）购于DIFCO 公司；流式荧光抗体购于 BD、eBioscience公司；RPMI1640培养液和胎牛血清均购自于 Gibco公司。HCPT：5ml：10mg/支。1.3实验分组将30只DBA-1 小鼠分3组：正常对照组、 CIA 阳性对照组、HCPT治疗组，每组10只。1.4CIA模型诱导及评价：第 0天，CIA 组和HCPT组每只小鼠给予 100μ乳l化抗原，于尾根部2～3cm处皮下注射；第21天加强免疫，以CII溶液和等量的IFA乳化后的抗原在小鼠背部两侧皮下注射。HCPT组从第1天至第20天给于HCPT100μg/kg/天。第22天开始观察小鼠发病情况。CIA评分标准如下：0分，无异常表现；1分，不严重踝关节有一定的发红和肿胀，或在个别足趾出现发红和肿胀；2分，踝关节出现中度红斑及肿胀；3分，包括足趾在内的爪子出现严重红斑、水肿；4分，涉及多关节的重度肿胀的肢体。每只小鼠四肢评分之和为关节炎评分。1.5小鼠关节病理改变分析：将小鼠处死后取患病关节，置于10%福尔马林中固定，经脱钙等处理制成石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察病灶炎性细胞浸润程度。1.6：CII特异性T细胞增殖实验：收集CIA小鼠脾脏细胞，调整细胞数为5×106/ml，加入不同浓度的CII刺激（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），37℃、5%CO2培养48～56h，每孔加入1μCi的放射性同位素H3-TdR，继续培养至72h，抽膜、洗板、加入闪烁液后读取cpm值。1.7小鼠外周淋巴结T细胞亚群检测：在小鼠发病高峰期取淋巴结制备单细胞悬液，加入流式荧光抗体以FITC-anti-CD4、APC-anti-IFN-γ、PE-anti-IL-17通过胞内染色标记Th1、Th17细胞，以APC-anti-CD4、PE-anti-CD25、FITC-anti-Foxp3通过胞内染色标记Treg细胞，检测各群细胞表达水平。1.8细胞因子检测：将脾脏制备的各组单细胞悬液（1×107/ml），体外加入CII（20μg/ml）刺激。于37℃、5%CO2培养箱中培养48h收集上清，ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-17、TGF-β的含量。1.9统计学方法采用Students'ttest、单侧ANOVA学意，P<0.01表示具有高度统计学意义。

检验分析组间差异。

P<0.05

表示具有统计结果2.1HCPT处理对小鼠发病的影响：二次免疫后每天观察小鼠发病情况并进行评分，CIA组小鼠发病率为100%，HCPT处理组小鼠发病率明显降低，为57%，CIA组小鼠约在首次免疫27d开始发病，而HCPT处理组发病稍有推迟，关节评分明显低于CIA组，且病情进展较为缓慢，患病高峰期评分远低于CIA组。HCPT处理组小鼠患肢肿胀程度较CIA组轻微。关节切片经HE染色，CIA组小鼠关节软骨存在一定程度的破坏，炎性细胞浸润较为严重，HCPT处理组小鼠关节炎性细胞浸润较少，软骨破坏不明显。在发病后期（首次免疫45～50d左右），小鼠病情虽都有所缓解，但HCPT组关节评分明显低于CIA组，两组评分具有统计学差异（P<0.05）(图1）。6HCPTe5CIArNomaloc4slaci3nil＃P＜0.05c2aeM10272931333537394143454749515355575913579111315171921232527293133DaysPostImmunization图12.2HCPT处理对CII特异性T细胞增殖能力的影响： 通过H3增殖实验检测小鼠脾脏单个核细胞对CII的反应性，结果显示， HCPT处理可显著抑制 CII 特异性T细胞的增殖（图 2），提示HCPT对CIA 的疗效可能与其抑制 CII 特异性T细胞的增殖相关。40NormalHCPT30 CIA)301×20(mpC1000521032041CII(ug/ml)图22.3HCPT处理对小鼠T细胞亚群的影响： 图3a,3b显示，炎症细胞 Th1、Th17在CIA 组中的表达明显高于正常组，Th17细胞在CD4+T细胞中百分比高达正常组中的3倍，Th1细胞百分比也明显上升。经过HCPT处理后，两群细胞的百分比可下降至约2/3，HCPT组与CIA组相比差异具有统计学意义（图3a，P<0.05）。这些细胞在体外分泌细胞因子的能力由图3b所示，相较正常组，CIA组小鼠细胞上清中Treg相关细胞因子TGF-β分泌水平下降明显，经HCPT处理后可出现明显的改善，TGF-β含量明显升高；CIA组小鼠细胞上清中炎症因子IFN-γ、IL-17的含量明显升高，经HCPT处理后可出现明显的改善，IFN-γ、IL-17的水平降低(P<0.05)。8)%6(T4DCni 4tnecrep 203000)1-lm.g p(/noitartn 1000ecnoC0

NormalCIAHCPTTh1Th17图3aNormalCIAHCPTTGF-β IFN-γ IL-17图3b讨论类风湿关节炎（ RA）是一种常见的自身免疫性疾病，临床表现多样，目前发病机制不明。大量研究表明， 该病的发病与细胞免疫功能紊乱密切相关。 长期以来，免疫抑制剂一直是RA治疗的基础。如甲氨蝶吟、来氟米特、环孢素 A、硫唑嘌呤及环磷酰胺等 [4]。上述药物的应用一定程度上控制了 RA的病情进展，原因在于RA具有类似于“局部恶性肿瘤” 的增生性和破坏性的特点。由于 10-羟基喜树碱（ HCPT）具有较强的抗肿瘤作用，从抑制细胞增殖的角度分析，该药物可以通过抑制淋巴细胞活性， 进而抑制机体的异常免疫反应， 因此，该药物从理论上能够起到控制 RA疾病发展的作用，我们的前期工作也证实了这种推测。因此，HCPT极有可能成为单用或与传统DMARDs联合用药的治疗RA的新型药物。HCPT是如何起到抑制RA滑膜炎症的作用呢？我们在CIA模型中对上述机制进行了初步探讨。CIA是与人类RA相似的自身免疫性疾病动物模型，T细胞和B细胞对CII的过度应答是其发病机制中的一个显著的特征[5]。我们的研究显示HCPT处理后可推迟CIA小鼠的发病，研究结果显示，从发病起始至患病的晚期，HCPT处理组的小鼠关节评分均明显低于阳性对照组，小鼠关节切片中炎症细胞浸润程度较低，软骨并未受到明显破坏。从增殖实验观察到，HCPT处理组小鼠体内CII特异性T细胞对CII的增殖反应明显下降，上述结果提示，HCPT干预可抑制CII特异性T细胞的反应能力。在CIA发病早期的滑膜中即可分离出大量的Th1、Th17细胞，提示这些细胞参与了小鼠局部炎症浸润。多数学者认为，IL-17可能是介导炎症发生的关键，且与炎症的严重程度相关[6-9]。Treg细胞是IL-10、TGF-β的主要来源，其作为抑制性T细胞调节免疫平衡。在RA关节滑膜中，Treg细胞生成明显减少，伴有Foxp3基因水平表达下降[10]。另外还有体外实验发现，RA外周血中Treg虽然可以抑制炎性细胞增殖，但是并不能抑制IFN-γ及IL-17的产生。由此，Treg细胞效应及表达量的下降与Th1、Th17细胞的过度表达打乱免疫系统的自稳，这种失衡进而造成自身免疫性疾病发生。我们检测了不同组小鼠体内Th亚群的变化发现，与未处理组相比，HCPT组小鼠体内Treg细胞在CD4+T细胞中的百分比明显高于CIA组，体外其分泌细胞因子TGF-β的能力也显著增强，而Th1、Th17细胞在HCPT组中的表达下降，分泌炎症因子的能力也被抑制。这些结果表明，HCPT预先干预CIA小鼠可诱导小鼠产生免疫抑制效应，进而降低体内免疫系统对CII抗原的敏感性而抑制疾病的发生发展。本研究结果显示，HCPT干预CIA小鼠后，可上调Treg细胞在CD4+T中的百分比，CD4+CD25+T细胞在CD4+T细胞中的百分比亦有所上升，CD25作为细胞激活的标志，在HCPT处理中其表达上调，提示HCPT可能诱导小鼠体内与Treg细胞表达相关因子的产生，进而抑制其他自身反应性T细胞的增殖分化。综上所述，我们的研究结果表明应用HCPT干预CIA，可降低自身反应性T细胞的增殖，并且还可上调Treg细胞，抑制Th1、Th17细胞及其炎症因子水平，通过恢复Treg细胞与Th1、Th17细胞的免疫平衡最终抑制CIA的发病。本研究为HCPT治疗自身免疫性疾病提供了新的理论依据，丰富了对其免疫调节机制的认识。【参考文献】NadkarniS,MauriC,EhrensteinMR.Anti-TNF-alphatherapyinducesadistinctregulatoryTcellpopulationinpatientswithrheumatoidarthritisviaTGF-beta[J].JExpMed,2007,204(1):33-39.苗平，张冬青．IL-6/IL-6R与类风湿关节炎关联性研究进展[J]．免疫学杂志，2011，26（4）：353-356．LamacchiaC,PalmerG,SeemayerCA,etal.EnhancedTh1andTh17responsesandarthritisseverityinmicewithadeficiencyofmyeloidcell-specificinterleukin-1receptorantagonist[J].ArthritisRheum,2010,62(2):452-462.栗占国.类风湿关节炎。见：施桂英主编.关节炎概要。北京:中国医药科技出版社，2005，333-361。[5]MarcińskaK,SzczepanikM.Mechanismsinvolvedintheregulationofimmuneresponseinanimalmodelofrheumatoidarthritisinmice(CIA)[J].PostepyHigMedDos64(4):372-385.

’w(Online),2010,[6]HarringtonLE,HattonRD,MansanPR,etal.Interleukin17-predocingCD4+effector