RNA干扰应用研究进展

RNA干扰及其应用研究进展老表（河南城建学院，河南，平顶山）摘要：RNA干扰是一种由双链RNA引发的序列特异性的转录后基因沉默，它是沉默目的基因表达的一种有效手段。本文针对植物而言进行综述RNA干扰及其研究进展。关键词：RNA干扰；基因功能；抗病毒；品种改良Abstract：RNAinterferenceisasequence-specificpost-transcriptionalgenesilencinginducedbyintroductionofdoublestrandedRNA.Itisapowerfultooltosilenttargetgeneexpressions.Inthispaper,theRNAinterferenceanditsresearchprogressweresummarized.Keyword:RNAinterference；Genefunction；antiviral；Improvedvarieties前言：在研究生物体早期发育时通常以抑制特定基因的表达来研究该基因在生物体生长发育中的作用。RNA干扰作为一种反向遗传学的研究方法，为后基因组时代的基因功能分析提供了一种可靠而又快速的应用技术平台。RNA干扰的定义RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达使其沉默的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。这一现象已在植物、真菌、锥虫、涡虫、囊虫、水螅、果蝇、线虫、斑马鱼、老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中被发现。RNAi的作用机制与特点RNAi发生的主要过程大致分为3个阶段：(1)起始阶段，dsRNA在细胞内被RNaseIII(如Dicer)均匀切割成21-25nt大小的siRNA；(2)效应阶段，siRNA和内切核酸酶以及其它蛋白一起形成RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)。RISC的核酸部分起到靶向性的作用，蛋白部分则起到降解mRNA的作用；(3)扩增阶段，siRNA与mRNA靶向性结合，并作为引物，在RdRP作用下再次形成dsRNA，新形成的dsRNA又被Dicer切割成siRNA，新形成的siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的。因此，可以通过构建表达dsRNA或者siRNA来实现RNAi的功能。RNAi的应用研究进展植物基因功能研究中的应用自2001年《Nature》首家报道在哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具应用于低等生物高等动植物领域。在水稻和拟南芥的基因组测序完成后，人们获得了众多的候选基因，RNAi为注释和认识这些基因对植物体的作用提供了一种快速、高效的鉴定方法。由于拟南芥是目前植物基因组资源研究最深入的植物种类，所以RNAi技术在植物功能基因组中的研究主要体现在拟南芥功能基因组的研究上。Chuang等用RNAi技术证实了AG、CLV3、API、PAN基因在拟南芥花的发育过程中所起的作用。Senthil-kumar等通过RNAi技术发现2个VHA-c-基因—VHA-c1和VHA-c2，他们在拟南芥生长中通过主动胞外分泌向细胞供给V-APTase，支持扩增细胞的生长。Frankish在Arabidopsissuecica中使用RNAi的方法证实了通过合理设计双链RNA就可以有效地使一个基因家族沉默。在其它植物中沉默，使花的颜色由原来的蓝色变为白色或苍白色。最近McGinnis等设计由RNA干扰减少目的基因表达的反向重复定位的短基因片段，并将此基因片段导入玉米愈伤组织中，筛选得到了稳定遗传的转基因系。因此,RNAi作为基因功能研究的重要技术，具有简单、快捷、高通量的特点,可以快速获得单一基因差异的转基因植株，对植物基因功能的研究很有益处。植物抗病毒研究中的应用利用RNA干扰技术的原理可设计合成与病毒同源的dsRNA，并将其导入植物体，由于植物体的RNA干扰机制对病毒基因组进行特异性切割降解，阻止病毒的复制扩张,从而保护植物体不受病毒危害。自从1986年Powell-Abel等首次将烟草花叶病毒(TMV)的衣壳蛋白(CP)基因导入烟草,获得抗TMV侵染的转基因烟草以来,很多研究人员将病毒的不同基因序列导入植物均获得抗病毒植株。Ma等根据抗水稻矮缩病毒序列,构建了与其相关的RNA干扰序列,导入水稻中,发现对水稻矮缩病毒有很高的抗性。赵明敏等以烟草花叶病毒(Tobsccomosaicvirus,TMV)外壳蛋白基因为靶位,设计合成siRNA,通过农杆菌介导的方法导入烟草中,瞬时表达的结果表明设计的干扰序列对TMV有明显的抑制作用。此外,同源于TMV外壳单边的siRNA瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)没有抑制作用,这表明siRNA干扰作用具有高度的同源依赖性。另外,Andika等证实RNAi诱导的抗甜菜坏死黄色叶病毒(Beetnecroticyellowveinvirus,BNYVV)在叶中比根部有效。虽然利用siRNA干扰技术对抵抗植物病毒有一定的作用,但是最近的研究发现病毒中含有能编码抑制植物对病毒RNA干扰的蛋白质,目前人们还不清楚其机制,这些沉默抑制蛋白在对沉默的抑制方面各具特点,但对siRNA干扰都有一定的抑制作用。如Varqason等发现P19蛋白(一类由番茄丛矮病毒科病毒编码的蛋白质,分子质量为19kD)可以特异性的结合21～25nt的siRNA形成复合物,阻止RISC的形成从而降低参与到RNA干扰中或扩散至其它组织引发RNA干扰的dsRNA的数量,使沉默作用不能维持,结果导致沉默抑制效应。作物品种改良中的应用长期以来人们都采用常规育种的方法改良作物的品质,常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功,但育种年限长,并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料,而利用RNA沉默技术,可操作基因的范围和突变的种类扩大了,而且对目的基因的表达有了可控性。我们构建两个抑制矮牵牛查尔酮合成酶(CHS)基因表达的RNA干扰载体pBI121-CHS,并用基因枪转化和农杆菌介导的遗传转化方法转入矮牵牛植株中,发现其对矮牵牛花色产生部分干扰效应。利用RNA沉默技术进行小麦淀粉品质改良的研究,使颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-boundstarchsyn-thaseI,WAXY)基因沉默,得到了直链淀粉含量明显下降的植株，我们利用RT-PCR技术克隆到了油菜PEP基因片段,并构建了对应于PEPase基因的RNAi载体,用RNAi技术抑制油菜PEPase基因的表达,使代谢流偏向油脂合成,从而提高油菜籽粒中的油脂含量。对siRNA干扰在番茄中的应用研究较多,Davuluri等利用一个果实特异启动子在番茄中沉默内源的光形态发生调控基因DET1,提高了类胡萝卜素和类黄酮含量,但却不影响野生型的其它特性；我们根据ACC氧化酶基因的序列,利用RT-PCR技术,设计出siRNA干扰结构,通过遗传转化,69%的转化植株表现出100%的RNA干扰效果,番茄果实从破色期到成熟期需要120d；18%的植株表现出50%干扰效果,果实从破色期到成熟期需要30d,而对照果实从破色期到成熟期只需5d。我们根据番茄红素环化酶基因序列构建了siRNA干扰结构,将其导入番茄中,发现转基因番茄果实中番茄红素含量均比对照高,番茄红素的平均含量是对照的2.1倍,其中1号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多,是对照的2.6倍.从以上成果可以看出,利用RNA干扰技术可以有效地提高或抑制直目的基因的表达,这对作物品质改良有非常积极的意义,且育种年限短,对年改良作物品种十分有益。5.4植物抗逆性方面的应用ＲＮＡ干扰技术应用于植物抗逆性方面的研究尚处于起始阶段,但对模式植物拟南芥的研究中发现,经不同胁迫处理的拟南芥中含有分别归属于15种基因家族的26类新ｍｉＲＮＡ。Ｆａｔｒｍａ等的进一步研究表明,在4℃冷休克胁迫下诱导产生的ＢＭＹ8ＲＮＡｉ株系能够特异的适应冷休克胁迫,具有ＢＭＹ8表达表型的ＢＭＹ8ＲＮＡｉ株系在4℃冷胁迫下处理6ｈ后,与野生型相比体内麦芽糖含量明显降低。实验表明在冻胁迫作用下增加植物体内麦芽糖含量有助于保护电子传递链上的蛋白质。4.3. RNAi的应用前景RNAi不仅为大规模高效而复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台,也是植物遗传改良的有力工具。此外,RNAi技术将可能成为研究细胞信号传递途径与基因治疗的新途径之一。但是,RNAi作为一项新兴的分子生物学技术,其发展仅数年时间,大多数研究是在细胞水平进行,RNAi技术对整个生物体的影响仍不明确,对作用于不同靶位RNAi的效应存在差异的机制。因此，RNAi技术的安全性和稳定性等问题仍有待进一步深入研究。参考文献徐俊，毛颖，苗荻等.RNA干扰技术的研究进展［J］.医药生物技术，2012，(2):12-17.张翊,裴德宁.RNA干扰研究进展［J］.中国肿瘤生物治疗杂志,2003,10(1):68～70.吴元明，陈苏尼．RNA干涉的最新研究进展．中国生物化学与分子生物学报，2003，19(4)：411-417．马建,刘艺苓,王丕武.植物ＲＮＡ干扰的研究进展.中国油料作物学报,2008,30(2):252-259.赵明敏,赵建,郭永清,等.ＲＮＡ干