《生物技术药物》word版参考模板

9/9生物技术药物总结第一讲 总论生物技术药物(BiotechdrugsorBiopharmaceuticals)：指采用生物技术生产的用于疾病的预防、治疗和诊断的制品。生物技术：指以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。主要包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、抗体工程。生物技术药物分类（按化学特性）：天然生物技术药物；重组活性蛋白、多肽；基因药物（核酸药物）第二讲 基因工程基本过程与方法（一）原核表达载体（大肠杆菌）功能元件：启动子及调控序列、核糖体结合位点、松弛型复制子、转录终止区、多克隆位点、筛选标记哺乳动物细胞表达载体功能元件：原核DNA序列、启动子、终止子和多聚腺苷化信号、拼接信号、筛选标记第三讲 基因工程基本过程与方法（二）——基因文库的构建、基因工程中的常用酶、DNA测序cDNA文库：指通过克隆的方法保存在宿主中的一群混合分子，这些分子中的插入片段的总和可代表某种生物全部mRNA序列。cDNA基因文库构建的步骤：①细胞总RNA的提取和mRNA的分离；②第一条cDNA合成：oligo(dT)引物引导的DNA合成法、随机引物合成法、特定寡核苷酸引物合成法；③第二条cDNA合成：自身引物合成法、置换合成法、外加引物合成法④双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖限制性核酸内切酶（同尾酶）：一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列并能切割DNA双链的核酸内切酶。识别序列特点：多数具有严格的识别序列；识别序列的长度:4~8个碱基对；序列特征：回文序列第四讲 基因工程基本过程与方法（三）——细胞转化与转染连接子导入受体细胞：转化：将质粒或DNA导入宿主细胞，引起细胞遗传的改变。转染：真核细胞的转化转导：通过噬菌体(或病毒)将宿主基因从一个细胞转移到另一个不同基因型的细胞中。※常用方法： 原核细胞：CaCl2感受态法、噬菌体体外包装法真核细胞：电穿孔法、DNA-磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法CaCl2感受态法：适用于革兰氏阴性细菌。原理：是钙离子与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲（HeatShock)发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，使DNA分子能够通过。优点：操作方便缺点：转化效率较低重组体克隆的筛选与鉴定：抗药性标记筛选、※兰-白斑筛选（α-互补）、DNA电泳检测α-互补：将缺陷α-半乳糖苷酶N端部分序列的质粒载体转入缺陷α-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌，并且在含有X-gal的培养基上选择性培养，用乳糖类似物IPTG作为安慰性诱导剂进行诱导。质粒转入宿主菌后，宿主与质粒产生的有缺陷的α-半乳糖苷酶之间可以形成互补，对X-gal进行降解可产生蓝色菌落，这就是α-互补现象。定点突变： 1、盒式诱变：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。2、寡核苷酸引物诱变：指应用合成的寡核苷酸片段作为诱变剂，诱发基因或DNA片段中特定位点发生突变的技术。3、PCR诱变寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优点保真度高简单易行突变效率高操作简单突变成功率高缺点突变效率相对低操作复杂周期长受到酶切位点的限制后续工作复杂TaqDNA聚合酶保真性偏低第五讲 原核表达系统启动子（promotor）：是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。核糖体结合位点（RBS）：遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。它是起始密码子AUG上游的一段非翻译区序列。常用的启动子转录调控系统Plac转录调控系统：弱,IPTG诱导lPL和lPR转录调控系统:强，热诱导Ptrp转录调控系统:强，吲哚丙烯酸Ptac转录调控系统：强，IPTG诱导PT7转录调控系统：转录活性高，特异性强；IPTG诱导表达形式： 蛋白质结构：非融合型表达：天然完整蛋白融合型表达：如GST融合表达蛋白融合型表达：如GST融合表达蛋白优点：1、转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列调控，表达效率较高2、融合蛋白较天然真核蛋白更稳定3、可以利用识别原核肽段的配体进行亲和层析纯化4、融合蛋白分子量大，易于电泳鉴定表达部位：包涵体、周质表达包涵体：存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原因：目的基因的高表达，使蛋白无足够时间进行肽链折叠，产生凝集；种种原因引起的蛋白不能正确折叠；蛋白的性质；温度、pH值等环境条件的影响等。特点： 1.简化外源基因表达产物的分离操作：2.能在一定程度上保持表达产物的结构稳定周质分泌表达的特点分泌后的蛋白产物不含氨基端甲硫氨酸原核生物细胞质中的还原环境不利于蛋白二硫键的形成，而氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境，便于新生肽链折叠成天然结构，从而获得完全生物活性的重组蛋白一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白在周质中稳定性提高第六讲真核表达系统※真核表达载体的主要构件：启动子和增强子、终止信号和poly(A)信号、剪接信号；允许载体在细菌内扩增的序列：复制起始位点和抗药性标记基因；多克隆位点：插入外源DNA片段用于筛选出外源基因已整合的选择标记：抗生素抗性基因，如：neo基因：使细胞产生对新霉素衍生物G418的抗性。营养缺陷型基因，如：二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因等等显性活动调控区(dominantcontrolregion,DCR)序列，克服因载体整合在宿主基因组不同位点而产生的表达水平降低。酿酒酵母作为表达宿主的优缺点优点： 1、安全无毒、不致病； 2、遗传背景清楚，易进行遗传操作；3、培养条件简单； 4、易进行载体DNA的导入缺点： 1、发酵时产生乙醇，乙醇的积累会影响酵母本身生长，较难进行高密度发酵2、蛋白质的分泌能力较差 3、常发生过度糖基化毕赤酵母表达系统优缺点优点：(1)高表达：表达载体一般利用醇氧化酶基因（AOX1）的启动子，功能很强。(2)高分泌：应用啤酒酵母因子的前导序列，有很好的分泌效果，有些蛋白分泌表达可10g/L；(3)高稳定：一般用整合型载体YIP，整合于染色体上，构建的转化子菌株十分稳定；(4)糖基化功能较啤酒酵母更接近高等真核生物。缺点：(1)分子生物学研究基础差，对其进行遗传改造困难较大;(2)发酵虽能达高密度，但发酵周期较长;(3)不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，因为AOX1启动子是被甲醇调控的，当毕赤酵母以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源时，菌体可以生长，但AOX1启动子是关闭的，当这些碳源耗尽，添加甲醇时，AOX1的mRNA可占总mRNA5%。昆虫表达系统的优缺点优点： 1、插入较大的外源基因，借助多元表达载体可以同时表达多个外源基因；2、表达载体一般使用多角体蛋白或p10等强启动子，实现蛋白的超高表达，可以达到细胞总蛋白的25～50%；3、能有效地进行蛋白质翻译的加工，如糖基化、脂酰化和磷酸化；4、杆状病毒有严格的宿主细胞专一性，对脊椎动物和植物即不能感染也不能在非宿主细胞中繁殖或发生整合，因此十分安全。缺点：1、不能连续合成重组蛋白，因为昆虫细胞感染病毒后4～5天后就死亡，无法继续表达蛋白；2、多角体蛋白及p10启动子控制的基因表达是在感染的晚期，所以表达产物的翻译后加工可能是不完全的；3、费用昂贵，目前培养昆虫细胞需加胎牛血清，特别是在大规模悬浮培养时更增加了生产成本。重组病毒获得：了解大框架第七讲 植物基因工程植物基因工程抗体：是利用基因工程技术在植物中表达生产的抗体，即将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物，在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段。农杆菌载体系统：农杆菌是一种天然的植物遗传转化系统。根癌农杆菌和发根农杆菌是土壤中的植物病原菌，能感染大多数双子叶植物的受伤部位，分别诱导冠瘿瘤和发状根。冠瘿瘤和发状根分别由根癌农杆菌中的Ti质粒和发根农杆菌中的Ri质粒引起农杆菌转化植物体的方法叶盘法：将叶圆片放入农杆菌菌液一段时间，然后转移到培养基上，使转化细胞再生植株；整株感染法：用农杆菌感染植株创伤部位，然后无菌培养癌瘤组织，从愈伤组织分化出转基因植株；共培养法：将原生体（去细胞壁的植物细胞）与农杆菌一起培养，离心去菌，在选择培养基上得到转化细胞系，最后再生得到转基因植株第八讲 蛋白质分离纯化蛋白质浓度测定：常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种凝胶过滤层析（分子筛层析）：凝胶是具有网孔结构的颗粒，当分子大小不同的蛋白质混合液流经凝胶装成的层析柱时，比凝胶网孔小的蛋白质分子进入网孔内，比凝胶网孔大的蛋白质被排阻在外，当用溶剂洗脱时，大分子先被洗脱，小分子后被洗脱亲和层析：是利用蛋白质分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲合力而得以分离纯化的技术。原理①亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为吸附剂。②当含有混合组分的样品通过时，只有与该分子有特异亲合力的物质才能被吸附结合，其它没有亲合力的无关组分随缓冲液流出。③改变缓冲液组分，将结合的亲和物洗脱下来离子交换层析：利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的蛋白进行分离的方法。分类：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂。原理：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化目的。第九讲干扰素和白细胞介素干扰素：是由病毒和其他种类的诱导剂，刺激巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一组复杂的蛋白质。这类蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。干扰素的生物学活性：抗病毒（I型）：诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制；增强NK细胞对病毒感染细胞杀伤；促进MHC-I类分子表达，增强CTL的杀伤能力抗肿瘤（I型和Ⅱ型）：Ⅰ型：抑制肿瘤病毒的繁殖；抑制细胞增生、诱导分化、促进凋亡；增强NK细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤；Ⅱ型：增强机体免疫机制、加强免疫监督功能免疫调节作用（Ⅱ型）：活化巨噬细胞；促MHC-II类分子表达，提高APC抗原递呈能力；促MHC-I类分子表达，增强NK和CTL杀伤活性；调节T细胞和B细胞功能；抑制Th2细胞分化及细胞因子合成白细胞介素（Interleukins，ILs）：是一类由免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)和相关细胞(成纤维细胞、内皮细胞等)产生的高活性多功能的低分子量分泌蛋白。白细胞介素的生物活性：免疫调节活性：IL－2、4、5、7、9、10；炎症介导活性：IL－1、6、8；刺激造血活性：IL－3、11白介素作用特点：多效性，协同性，重叠性，拮抗性，迅速性，高效性，非特异性第十讲 促红细胞生成素与集落刺激因子一、※促红细胞生成素（EPO）产生部位：胎儿和新生儿——EPO主要由肝脏产生；成人——主要由肾脏产生，约占90％。分泌与调节：健康成人血浆中EPO水平为10-20U/L；EPO分泌受负反馈调节，当贫血或血氧浓度偏低时分泌增加。不良反应： ①高血压：初次使用EPO高血压的发生率约20%；；EPO纠正贫血后35-45%出现高血压；35-45% 原来存在的高血压加重②血管栓塞，脑梗死③高血压脑病④癫痫第十一讲 治疗性抗体工程药物基因工程抗体（Geneticengineeringantibody,GEAb）：利用DNA重组技术，将编码鼠和人抗体的基因或其片段进行切割、拼接或修饰，或直接合成基因序列，插入载体后进行表达。嵌合抗体（美罗华）：用人抗体的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区，形成人-鼠嵌合抗体。恒定区人源化人源化抗体（赫赛汀）：把鼠抗体可变区的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。关键：确定影响抗原结合部位的骨架区氨基酸残基小分子抗体：Fab、ScFv、dsFv、双链抗体、单域抗体、连接物单链可变区片段ScFv双链抗体：一种双价特异性抗体片段，含有2个不同的抗原识别模块能同时识别2种不同抗原决定簇的小分子抗体。通常一种对应肿瘤相关抗原，另一种对应效应成分。完全人抗体：转基因鼠；转染色体鼠（鼠体液免疫系统的“人源化”）第十二讲 转基因动物转基因动物概念：狭义：将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物，称为转基因动物（Tg）。广义：通过对动物基因组的改造和修饰，获得通常可种系传代的遗传性状的动物，叫做转基因动物。※转基因动物的主要技术流程：载体的构建→原核显微注射/基因打靶→移至假孕鼠→检测子代小鼠→转基因小鼠品系建立乳腺生物反应器：指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。制备：1、构建表达载体 2、获取受精卵 3、显微注射 4、移植到假孕母鼠体内5、转基因小鼠鉴定 6、转基因小鼠品系建立第十三讲多肽药物多肽药物研究开发的几个主要方向1、多肽疫苗 2、抗肿瘤 3、抗病毒 4、抗菌肽5、细胞因子模拟肽 6、多肽导向药物 7、用于心血管疾病的多肽诊断用多肽多肽药物的生产方法：①动植物组织提取（天然活性多肽） ②蛋白降解（酸、碱降解或酶解）：大豆肽、海参肽等营养品③化学合成：固相合成法 ④基因重组表达，发酵生产。第十四章 核酸药物反义药物：利用反义技术研制的药物称为反义药物，通常是指反义寡核苷酸。包括反义DNA、反义RNA、核酶等。其DNA或RNA单链片段，具有特定基因或其mRNA互补配对的碱基序列，可特异性阻断基因的表达。反义药物作用机制： ①AS-OND与靶标RNA杂合后激活RNA酶H，降解mRNA②影响前体mRNA剪切③阻断蛋白质的翻译（针对5`帽区）④作用于polyA位点，影响mRNA稳定。⑤反基因作用⑥核酶：具有酶催化活性的RNA分子，可通过碱基配对特异性地与相应的RNA底物结合并将其裂解。锤头型核酶RNA干扰（RNAi）：是指