生化检测系统性能验证

生化检测系统

性能验证为什么要做性能验证？《医疗机构临床实验室管理办法》《ISOl5189—医学实验室质量和能力认可准则》

二者均要求，设备在临床应用之前必须要进行性能验证；

目的：确定设备能达到所要求的性能指标；设备的性能是否合格，对检验结果的准确性起决定性的作用。什么是性能验证？性能验证试验

对配套系统，一般验证下列指标：

―准确度(accuracy)---EP15-A―精密度(precision)---EP5-A2―线性范围（linearrange)---EP-6―可报告范围(reportablerange)---EP-6―参考区间(referenceinterval)---C28-A2

对非配套系统，验证更为广泛。什么时候做性能验证试验？1.方法或系统首次在实验室使用；

2.EQA(室间质量评价)或PT（能力验证）结果未通过，采取纠正措施后；

3.达到文件规定周期做性能验证时首先满足的实验条件仪器的维护保养仪器校准室内质控试剂、校准品（有效期、批号等）人员（SOP）

保证仪器在最佳状态一.精密度验证实验基本概念

测量精密度(measurementprecision)

在规定条件下，对同一或相似被测对象重复测量得到测量示值或测得量值间的一致程度。

1.测量精密度通常由不精密度的量度以数字表达，如规定测量条件下的标准差、方差和变异系数。

2.规定的条件可以是测量的重复性条件、测量的中间精密度条件或测量的再现性条件。

3.测量精密度用于定义测量重复性、中间测量精密度和测量再现性。基本概念测量重复性在一组测量条件下的测量精密度，包括相同测量程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和地点，并且在短时间段内对同一或相似被测对象重复测量。

1.在临床化学上，即所谓的批内精密度。

2.在评估体外诊断医疗器械时，通常重复性条件来代表基本不变的测量条件（被称为重复性条件），产生的测量结果是最小变异。3.重复性信息可对故障排除目的有用处。

基本概念测量再现性：在包括了不同地点、不同操作者、不同测量系统的测量条件下对同一或相似被测对象重复测量的测量精密度。

1.在临床化学上，即所谓的室间精密度。

2.在评估体外诊断医疗器械时，通常再现性条件代表了最大改变的条件（被称为再现性条件），产生于独立实验室间比较结果时遇到的测量结果变异，如发生在室间比对计划中（例如，能力比对）。

基本概念3.不同测量系统可使用不同测量程序。

4.应在实际程度上给出改变或不改变条件的说明。基本概念中间精密度在一组测量条件下的测量精密度，这些条件包括相同的测量程序、相同地点并且对相同或相似的被测对象在一长时间段内重复测量，但可包含其它相关条件的改变。

1.应在实际程度规定改变和未改变的条件，特别是如校准物、试剂批号、设备系统、操作者和环境条件等变量。

2.在体外诊断医疗器械评价中，一般中间精密度条件代表医疗器械在一长时间段内的实际使用条件。实验方法批内精密度在相同的测量条件下，在最短时间内（常是在同一测量批次内）对同一样品测量20次，由此计算出批内精密度。实验方法批间精密度在一段时间内（一般为连续20个工作日）对同一样品（常为质控品），每天测定一次，每次测定双份，由此计算出批间精密度。如果时间紧，也可改为测5日，每天分2批进行，每批重复测定2次，每次至少间隔2h，每个浓度每天能获得4个数据。由此计算出总精密度。实验样本的选择1.实验样本要稳定，其基质组成应尽可能与临床样本相似。一般常采用临床实验室收集的稳定和冷冻贮存的血清；

2.实验样本的浓度尽可能选择与厂商声明性能相近的浓度或接近该项目医学决定水平的浓度。

3.通常选择稳定性好的、血清基质的质控物作为实验样品。样本浓度的选择1.精密度大小和样品浓度有关样品浓度高时，虽然标准差的绝对值较大，但变异系数往往变小。所以评估精密度时，建议评估高低二个浓度的精密度。当二个浓度的精密度有显著差异时，建议增加为三个浓度。样本浓度的选择2.所选浓度应在测量范围内有医学意义的值，即至少有一个浓度在医学决定水平(medicaldecisionlevels)左右。

不要为了得到较小的精密度，都选用较高值的样品，甚至超出测量范围。也不应选用靠近最低检出限的样品，此时所得的精密度往往偏大。如没有医学决定水平，可在参考区间上限左右选一个浓度。此外再根据检验项目的性质在线性区间内选择一个值。试剂和校准品的要求

在整个阶段，尽可能使用相同条件，应使用同一种类同一批号的试剂和校准物，如有可能，只进行一次校准。使用不同批号试剂和多次校准都会增加检验结果的变异程度。质量控制

检验时应同时至少测一个质控品。当质控品结果超出规定的失控限，不论实验结果是否满意都应弃去不用，重新进行试验以取得实验数据。要保存所有的质控数据和失控处理记录。在正式实验前操作者应熟练掌握1.操作程序

2.保养程序

3.样本准备

4.校准及检测程序

数据收集

分析前，检查数据中有无由于偶然差错引起的离群值(outliers)。离群值的标准：任何结果和总均值的差超过4个标准差。为了能收集到至少20个有效数据，除补充由于质控失控而增加的测试外，还应再增加由于离群值不用于精密度的计算所需增加的检验次数。数据收集

进行批内精密度评估实验时，一次只能有一个离群值，当不接受数据超过2个，应怀疑是否为方法不稳定或操作者不熟悉所致。此时应不用此次试验数据，检查问题和解决问题后重新开始新的评估实验。*必须保留任何离群值和室内质控失控的记录。结果分析

计算均值、标准差和变异系数。从CLIA’88允许误差表中查阅评价的该项目的允许误差范围。

判断标准批内精密度—CV值要求低于1/4CLIA’88允许误差。批间精密度—CV值要求低于1/3CLIA’88允许误差。CLIA’88允许误差范围不涉及的项目：

EQA的允许误差试剂说明书提供二.正确度验证实验基本概念准确度（accuracy）指检测结果与被测量真值之间的一致程度。正确度（truness）指大批检测结果得到的平均值与真值的一致程度。通常用统计量“偏倚”来表示。偏倚（bias）指测量结果的预期值与可接受值间的差异。以检测计量单位或百分率表示，即平均值与参考值的差异。基本概念误差（error）指对于真值或对于可接受的、预期真值或参考值的偏离，分为随机误差和系统误差。总误差（totalerror）指某实验室用某方法在多次独立检验中分析某样品所得各个结果值与靶值之差在一定置信区间内的最大值。包括随机误差和系统误差，是不准确度的估计值。文件依据CLSI颁布的EP15-A文件《用户对精密度和准确度性能的核实指南》参考物质：选择有证的参考物质，或具有结果互换性的校准品，选择两个水平。样本比对：随机选取20份人源样本。

实验方案定值参考物来源1.已用参考方法或决定性方法定值的新鲜冰冻人血清或其他一些未掺入成分的人物质；2.从能力比对试验中获得的参考物；3.厂家提供的正确度确认物或质控物；4.实验室室间质评物；5.由第三方提供的已用一些不同方法定值的物质。实验方法（参考物质）至少要求测定2个水平，选择的水平应能代表方法的最低和最高测量范围；连续测定3-5天，每天一个分析批，每批两个浓度水平，每个浓度水平同一样品重复测定2次；统计连续3-5天的测定数据，计算得出均值、标准差和不确定度，并根据T临界值确定置信区间上下限；判断每个正确度验证物质指定浓度是否在数据统计得出的置信区间内。正确度验证-数据统计（参考物质）浓度水平指定浓度结果

次数第一天第二天第三天第四天第五天水平19.70第一次10.7010.509.9010.509.10第二次10.1010.409.1010.309.90水平234.20第一次38.2036.7036.6037.2033.80次二次36.0035.7035.9036.1032.10浓度水平测试计数均值标准差不确定度t-临界值上置信限下置信限水平11010.050.560.1783.2510.6309.470水平21035.831.730.5483.2537.61034.050结论水平1计算得出的95%置信区间为9.470-10.630umol/L;水平2计算得出的95%置信区间为34.050-37.610umol/L,包括参考物质水平1浓度:9.70umol/L和参考物质水平2浓度:34.20umol/L,实验验证数据能够证实正确度,正确度验证通过。实验方法（样本比对）检测20份患者样品，其浓度水平覆盖检测方法的可报告范围；在实验室以常规操作方式检测新鲜患者样品；在3-4天时间内,每天由试验方法和比较方法在4h内检测5~7份样品；评价质量控制程序，确保稳定的操作条件和有效的实验结果；检查比较数据识别任何异常的结果；计算配对结果之间的差值，并绘制差值与比较值之间的差值图，用图形显示；将数据进行配对t-检验计算，确定方法之间的平均差值以及差值的标准差；计算置信区间和验证限，将测量的差值（或百分差值）与厂家的声明进行比较。正确度YX序号试验方法比较方法Yi-XiYi-Xi-B(Yi-Xi)%(Yi-Xi-B)%11.8151.98-0.170.35-8.33%17.56%21.8152.01-0.200.32-9.70%15.80%31.127721.425-0.300.22-20.86%15.11%42.71043.155-0.440.07-14.09%2.16%51.63351.735-0.100.41-5.85%23.70%62.33533.435-1.10-0.59-32.01%-17.09%74.28345.505-1.22-0.71-22.19%-12.88%85.65077.67-2.02-1.51-26.33%-19.64%90.998251.05-0.050.46-4.93%43.89%100.676392.6-1.92-1.41-73.99%-54.27%1113.612513.1650.450.963.40%7.29%122.25062.475-0.220.29-9.07%11.65%132.89192.91-0.020.49-0.62%16.99%正确度验证-数据统计（样本对比）-1144.69485.66-0.97-0.45-17.05%-8.00%150.661871.55-0.89-0.38-57.30%-24.23%163.29123.435-0.140.37-4.19%10.74%170.785290.865-0.080.43-9.22%50.05%180.821590.770.050.566.70%73.27%191.77872.135-0.360.16-16.69%7.32%202.84353.4-0.56-0.04-16.37%-1.29%和

均值2.83388053.34650.510.65

AV(B3:B22)AV(C3:C22)

S(E3:E22)

Y均值X均值差值（B）差值标准差（SDdiff)

置信限pt临界值测试数n置信上限置信下限偏倚B偏倚sd0.012.8620-0.10-0.93-0.510.65厂家声明的变异系数10.00%验证区间上限验证区间下限

正确度验证-数据统计（样本对比）-2三.线性范围及可报告范围验证实验基本概念线性范围（linearrange)使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。线性（linearity）在给定的测量范围内，使测定结果与样本中分析物的量直接成比例的能力。基本概念分析测量范围（analyticalmeasurementrange）是患者样本不进行任何稀释、浓缩或其他预处理，由检测系统直接测量得到的可靠结果范围（测量结果不精密度和偏倚在允许范围内的分析物的浓度），在此范围内一系列不同样本分析物的测量值与其实际浓度呈线性比例关系。临床可报告范围（clinicalreportablerange)是定量检测项目向临床能报告的检测范围，患者样本可经稀释、浓缩或其他预处理，对于临床可报告范围大于分析测量范围的检测项目，需要进行最大稀释度实验，以确定临床可报告范围的上限，并结合临床决定水平和功能灵敏度（定量限）来决定该项目的临床可报告范围。文件依据CLSI颁布的EP6-A文件《定量测量方法的线性评价》仪器要求

应有较好的测定精密度不存在明显的携带污染等。对仪器应进行定期维护及校准，保证其处于正常状态。试剂及校准品要求试剂应注意试剂有效期及批号，不可采用过期试剂或不同批号的试剂。校准品可采用与评价试剂配套的校准品。校准品的使用应严格按照产品说明，仪器校准步骤与间隔应按照本室的标准操作程序进行。样本选择原则和类别样本选择原则和类别为避免基质效应对结果的影响，选用的样品应与临床实验样品相似。不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用物质的样品，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样品。样品物浓度应包括试剂厂商提供的试剂所能达到的线性范围。线性范围样品制备1.收集临床检测过程中的高值样品即浓度接近预期测定上限的患者血清（H）和低值样品(L)，若收集不到低值样品，可用生理盐水或蒸馏水替代。

2.将H和L样品按：1L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、1H关系各自配制(必要时可改变比例)混合，形成系列评价样品。线性范围样品测定进行线性范围验证时，应进行5个浓度水平的样品测定，并在1个批次测量中完成实验，每个样品至少重复测定2次，测量次序为随机；如果测定方法本身存在明显的携带污染，应根据实际情况采取恰当措施尽量避免对测定结果的影响。线性范围数据统计稀释比

(L:H)稀释度检测结果逸出值判断第1次第2次平均值理论值差异可接受范围4：011.611.481.555.64-72.616%±20.00%3：12172.91172.01172.46181.31-4.884%2：23360.04367.81363.93356.991.943%1：34542.92580.55561.74532.665.459%0：45674.08696.46685.27708.33-3.256%逸出值判断各检测数据均在有效范围内，检测数据有效。线性方程y=175.673x-170.031R²=0.995、斜率:=175.673、截距:-170.031结论R²>0.995，项目AFP结果呈线性关系；各稀释度水平差异在±20.00%范围内，厂家提供的分析测量范围1-800ng/ml可接受。线性范围数据绘图稀释度线性回归与理论浓度的差异分布线性范围结果分析以预期值为横坐标，以实测值为纵坐标进行线性回归，得到直线回归方程Y＝aX+b，a在0.97～1.03范围内，r2≥0.95。

可报告范围样品测定实验方法：可采用对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值得范围，可建立或验证仪器或检测系统测量相应的准确度实验结果值的范围。实验材料：1选用与检测仪器相配套的试剂，校准品及其他辅助试剂。2按照线性范围内供应商声明的或稳定的高值样本。操作步骤：1按标本操作规则做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。2选择线性范围内的3份高值血清标本，分别做2、5、10、20、50、100….倍的稀释，分别检测稀释后样本结果的浓度。测定结果记录在下表中。可报告范围验证实验数据记录四.分析灵敏度验证实验基本概念检测低限（LLD）指样品单次检测可以达到的非空白检测响应量对应的分析物量。功能灵敏度（FS)指检测系统可定量报告分析物的最低浓度。空白限（LoB)指在规定的可能性条件下，空白样品被观察到的最大检测结果。检出低值（LoD)指在规定的可能性条件下可以检出的样本中分析物的最小量。文件依据CLSI颁布的EP-17A文件进行灵敏度性能评价。功能灵敏度实验程序将校准品或质控品稀释后，在仪器上分别对不同浓度的样品连续测定20次，计算均值、标准差和变异系数，以不精密度（CV）≤20%时对应检测限样品具有的平均浓度即为功能灵敏度。五.抗干扰验证实验样本选择选取临床混合血清1例。不可采用溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样品。样品物浓度应尽量选择该项目正常参考区间内的浓度。干扰物的确定根据临床样品的特点，实验所选干扰物为：结合胆红素、游离胆红素、脂肪乳、维生素C(Vc)、血红蛋白。样本制备

将每一系列的干扰样品根据实验要求配制成4个不同浓度的样本血清，按照从低—高、高—低循环测定5遍，计算每个浓度下的均值与未添加干扰物的样品的相对偏差，并求取重复性的变异系数。判断标准

当相对偏差不超过±15%，重复性变异系数不超过10%时，可认为对应的干扰物浓度对测定结果无影响。

六.参考区间验证实验实验目的:

验证已知参考区间在本实验室应用的可接受性。实验方法1.从健康人群中抽出20个参考个体（最好能够覆盖各个年龄段）;2.依照实验室标准操作规程检测样本;3.发现离群值应弃用，并用新的参考个体代替，以确保测试结果不含离群值;实验方法4.如果20例参考个体中不超过1例（5％的结果）的检测值在参考区间外，则已知的参考区间可以接受。若2例以上超出