《实验瑶山树鼩第4部分：遗传质量控制》编制说明

《实验动物瑶山树鼩第4部分:遗传质量控制》（征求意见稿）编制说明《实验动物瑶山树鼩第4部分:遗传质量控制》专业标准编制组二0二二年三月工作简况（一）任务来源与项目编号为规范和统一实验动物瑶山树鼩遗传质量控制的具体操作，建立实验动物瑶山树鼩遗传质量控制技术规范，结合目前尚无实验动物瑶山树鼩遗传质量控制国家标准及地方标准，有必要制定实验动物瑶山树鼩遗传质量控制地方标准。本标准由广西壮族自治区市场监督管理局下达的2021年第二批广西地方标准制修订项目：《实验动物瑶山树鼩第4部分：遗传质量控制》（序号：2021-2015）。（二）主要起草单位本标准由广西中医药大学负责起草完成。（三）主要起草人员名单主要起草人员名单如下：研制人员姓名职务/职称专业所在单位项目负责人冷静教授免疫学广西中医药大学主要参加人员苏傲蕾讲师中西医结合基础广西中医药大学唐海波副研究员预防兽医学广西中医药大学张丽峰副教授免疫学广西中医药大学黄正团高级实验师动物学广西中医药大学肖健教授免疫学广西中医药大学杨庆利研究员免疫学广西中医药大学运晨霞教授免疫学广西中医药大学梁亮工程师微生物学广西中医药大学曹颖颖助理研究员预防兽医学广西中医药大学二、编制标准意义树鼩目前划归为攀鼩目(Scandentia)树鼩科(Tupaiidae)树鼩属。属于国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物。从解剖学分析，树鼩的免疫系统、内分泌系统和神经系统的组织形态特征与灵长类高度相似。滇西树鼩全基因组测序已完成，通过与多个物种基因组比较分析进一步证实了树鼩与灵长类亲缘关系最为接近。树鼩与人类在生理机能、生化代谢和基因组等方面的相似性远高于大鼠、小鼠、土拨鼠等常用啮齿类实验动物。树鼩的许多分子和细胞结构近似人类，同时树鼩具有个体小，易于操作，性成熟时间比较短，饲养方法简单且繁殖较快，价格相对便宜等优点。此外树鼩已被证实可感染多种人类相关病毒，包括EB病毒、乙肝病毒及丙型肝炎病毒等。因此树鼩有望代替灵长类动物作为某些人类重大疾病研究的动物模型，具有广泛的应用前景。瑶山亚种（T.b.yaoshanensis）是广西的一个特色物种资源，主要分布在广西金秀，是具有重要开发潜力的实验动物。瑶山亚种树鼩属于树鼩的一个亚种，目前没有关于瑶山树鼩遗传质量控制方面的标准，本项目解决了瑶山树鼩规范化繁殖生产控制管理，规定了实验动物瑶山树鼩遗传分类及封闭群的遗传质量标准。为瑶山树鼩的遗传质量控制提供了标准。三、标准编制及研究起草过程（一）标准前期工作2013年以来课题先后承担相关课题：广西科研条件建设与开发利用研究课题《广西瑶山亚种树鼩资源实验动物化研究与开发基地》（编号：广西科技基础条件平台建设14-91-03）；《广西瑶山亚种树鼩近交系培育和实验动物化的研究》（编号:桂科攻1347003-6）。课题开展了广西瑶山亚种树鼩实验动物化培育及种质资源基地基础建设：建立规范化实验树鼩饲养繁殖设施、设备，研究实验瑶山亚种树鼩实验动物化和资源保存技术和方法，建立资源基地。（二）标准研究过程广西瑶山亚种树鼩资源实验动物化研究与开发基地立项建设以来，课题组收集整理本基地及国内外已有实验树鼩质量标准、技术规程和相关技术资料。研究分析国内外各类标准制定的背景、指导原则、动物等级划分和质量控制参数设置的依据，研究分析我国发布执行的地方标准与现行实验动物国家标准架构上的异同点，分析比较国内国外标准和相关规程对实验树鼩质量控制要求的异同点。收集整理我们基地及我国实验树鼩已有研究成果，到实验树鼩其它的生产机构和一些省市相关实验机构（如云南的中国医学科学院医学生物学研究所、中国科学院昆明动物研究所）等进行实地调研，开展广西瑶山亚种树鼩饲养管理、微生物学、寄生虫学、遗传学、病理学、配合饲料和环境条件等方面的各项指标和参数的标准化研究，为标准制定提供数据。以实验瑶山亚种树鼩的标准化为目的，综合大量基础数据并结合实际操作中质量控制方面存在的不足和近年来实验动物国家标准在执行过程中暴露出的问题，提出实验瑶山亚种树鼩标准制定思路和基本原则以及相关指标和参数的设置范畴。本课题通过收集、整理和研究，补充了影响实验树鼩质量的各种基础数据的工作基础上，确定了制定标准的指导思想和基本原则。编制小组对取得的数据进行全面整理，根据试验结果，确定了实验动物瑶山树鼩的术语和定义、实验动物瑶山树鼩的驯化、饲养、繁殖的方法及注意事项，并在编制过程中咨询了内行专家，对收到的反馈意见进行分析、采纳、修改，形成了本标准的研究稿。四、标准立项后到目前的工作进展情况《实验动物瑶山树鼩第4部分：遗传质量控制》于2021年10月立项进行制定，按照《广西壮族自治区地方标准管理规定》要求，课题组2021年10月26日，确定广西中医药大学副校长冷静教授为编制组的总负责人，同时成立了标准编制小组，进行了任务分工。并对本标准的研究稿反复研究讨论，检阅查新国内外的相关标准更新情况，并咨询了中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心的代解杰和孙晓梅两位研究员相关的树鼩遗传质量控制更新情况，两位研究员对本标准进行电话及书面的交流沟通与指导。提出了标准研究稿中，出现实验动物瑶山树鼩、实验瑶山树鼩等概念混绕不清，指导我们明确的其定义：整个标准都统一为瑶山树鼩即可，瑶山树鼩属于实验动物。建议我们大标题名称确定为《实验动物瑶山树鼩第4部分：遗传质量控制》，但具体内容定义写瑶山树鼩，不加实验动物前缀即可。另外，也建议我们只写封闭群瑶山树鼩的遗传质量标准即可，不涉及到近交系等资料信息，课题组认真思考后，做了对应的修改与完善并形成了本标准的征求意见稿，并讨论优选了10名国内均为正高级的优秀专家作为征求意见的对象，目前已发给或准备发给国内的相关专家进行函审。共得的10位专家的积极回应，答应帮忙审阅，征集专家意见正在顺利推进中。五、意见征集情况及修改说明准备开始。六、标准审订情况尚未开始。七、标准编写原则及确定标准内容的论据（一）标准编写原则1.遵循《中华人民共和国标准化法》等法规和标准。2.本标准的格式和编写方法执行GB/T1.1-2009的规定。3.本标准的制定力求准确、系统，内容与当前云南省滇西树鼩的遗传质量控制地方标准紧密结合，同时根据瑶山树鼩实际差异，对遗传质量控制中存在的问题进行修订与改善，重视实际可操作性。（二）标准编写依据1.制定本标准的目的是规范和统一实验动物瑶山树鼩遗传质量控制的具体操作，建立广西瑶山亚种树鼩资源基地。2.本标准的编写以实验动物瑶山树鼩遗传质量控制的高效性、安全性生产高质量的实验动物瑶山树鼩为基本依据。八、标准主要技术内容(一)范围本标准列出了实验动物瑶山树鼩遗传分类、近交系及封闭群的遗传质量标准。（二）规范性引用文件GB14923实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制（三）主要技术内容及其说明1.野生瑶山亚种树鼩来源：野生瑶山亚种树鼩来源于产地-广西金秀大瑶山。瑶山亚种树鼩生活习性：瑶山亚种树鼩的外形非常像松鼠，善于攀缘树木，行动很敏捷。多活动于山地、平原谷地的森林或林缘灌木林地区，也可见于村寨附近的灌丛。树鼩食性杂，以昆虫为主食，其次是小型哺乳动物和甜果。清晨和傍晚是树鼩觅食的高潮期，进食时，它们都会用前面的双爪子抓住食物啃食，同时发出清脆、快速的嗒吱声，进食后常常舔舐双爪，表现出类似“洗脸”和“洗手”的动作。树鼩体内的分泌的尿液、唾液含有的气味在领土行为上发挥着重要的作用，雄树鼩的体液物质以及领土行为是由雄激素所产生控制的。缩小生活空间、增加同性别个体数量可使树鼩应激性增强而发生角斗，导致使其体重下降，雄性树鼩会出现性行为减退，血象、骨髓象各类细胞均升高。树鼩易受惊，对环境非常敏感的动物，外界环境发生刺激，树鼩即刻处于高度紧张状态。如果这种紧张状态延续时，树鼩体重会减轻，臭腺发育不正常，雄性个体的睾丸会缩小，睾丸位置也会发生改变，甚至因衰竭而死亡。处于妊娠阶段的雌性树鼩如果受到过度惊吓，会引起流产、早产、难产。如果哺乳阶段的雌性树鼩受到惊吓，则极有可能造成乳腺分泌上的障碍，或拒绝哺乳，甚至因臭腺功能的丧失而咬食仔树鼩。野生瑶山亚种树鼩实验室驯化饲养笼：不锈钢树鼩笼（380*260*300mm），每笼后面带PVC休息箱（200*100*140mm），四层冲洗式（4*5套笼）。实验室饲养环境：普通开放环境动物房，装有空调和排风扇，房间备用除湿机。控制环境条件：成年瑶山树鼩饲养室内温度控制在15～25℃，室内湿度控制在45～70%。天晴时可将窗口打开但必须确保纱窗关闭；若阴天则采用风机进行间断性通风；晚上关闭。每天150w日光灯人工光照12h（7:30～19:30）。室内禁止任何人为的响动，开关门必须最大限度的减少噪音。饲养员在室内手机调为振动并且禁止接听和拨打。注意观察记录树鼩饲养房内的温度、湿度、通风情况、氨浓度变化及饲养密度等。驯化饲养4.1个人防护：野生瑶山树鼩的病原微生物不确定性，为了饲养人员的安全，因此饲养员必须做好个人防护。进入工作区前必须穿戴好自己的防护装备，其包括工作服、头套、口罩、一次性薄膜手套以及深筒水靴。4.2饲养驯化过程：新野生瑶山树鼩主要是苹果等果蔬为主，新野生瑶山树鼩刚回来的第一周主要喂苹果、梨、萝卜、西瓜、黄瓜等果蔬，在饲料盒中添加几克饲料，第二周开始逐步增加饲料的量（大概每天每只10g左右），第三、第四周也一样逐步增加饲料的量，第五周过渡到饲料为主、果蔬为辅的日常饲养。饲养驯化过程中特别注意环境安静，同时密切观察野生瑶山树鼩的状态和吃食状况，有特殊的情况要及时调整饲养驯化进度。4.3日常饲养管理瑶山树鼩日常饲养：树鼩基础日粮是自由采食购自中国医学科学院医学生物研究所的配合饲料及苹果、梨、萝卜、西瓜、黄瓜等果蔬；饲喂时间早上8:00～10:00，喂日常饲料（25g/只）；下午14:30～15:00苹果等果蔬（40g/只），15:00～15:30日常饲料（15g/只）。饲喂的量应充分满足每只瑶山树鼩正常的新陈代谢，切忌浪费，增加不必要的成本。定时定量给与树鼩食物，尽量降低树鼩因饲喂时间和量不同所造成的应激，以保障树鼩正常的生长、发育、繁殖。按需供给纯净水，每天按时更换。4.4日常卫生管理盛料槽必须保证清洁卫生无污染而且用优氯净液浸泡清洗（2~3次/周）。苹果用高锰酸钾液或优氯净液浸泡10分钟后清洗干净，切块饲喂。每次喂饲料前将剩余饲料倒出，加入新料（同时做食欲记录）；苹果饲喂后若有剩余须捡出。每天早上清扫粪便完成后饲喂；至少每周（最好每天）对地面进行喷雾消毒一次；每月对饲养房进行彻底消毒一次。4.5树鼩饲养笼的清洗消毒饲养人员每个月逐一对饲养笼至少进行1次彻底的清洗消毒，在整个过程中饲养人员必须穿戴好工作服、帽子、口罩、橡胶手套、深筒水靴以及防水衣。将瑶山树鼩转移至清洗消毒好的饲养笼。工作人员相互配合将饲养笼取下并转移至清洗消毒室。对饲养笼进行无死角的清洗。清洗完毕后将饲养笼放入消毒池浸泡30分钟以上。消毒液的配制：84消毒液按2%浓度配比后浸泡饲养笼，过氧乙酸液0.5%浓度配比后浸泡饲养笼。饲养笼浸泡后再次用清水彻底清洗。最后将饲养笼放至储存间备用。饲养架于房间内用抹布擦洗干净后用三氯异氰尿酸按1:1000～1:2000的浓度进行喷雾消毒。4.6筛选基础种群瑶山亚种种树鼩选择体况好无伤残，被毛光亮，母树鼩乳头大且均匀，公树鼩睾丸明显，另外还要注意不选择有下列情况的树鼩作为种用：被毛脏乱、无光泽或脱毛的树鼩；雌树鼩体况过于消瘦或肥胖，体重偏离正常范围（160g~210g）的母树鼩；骨盆腔狭窄的母树鼩；雄树鼩阴茎过短或隐睾的公树鼩。4.7结果与分析4.7.1野生瑶山亚种树鼩实验室饲养的成活情况2014~2016年期间，我们在广西金秀大瑶山捕获野生瑶山亚种树鼩152只，有6只是因为捕捉或者运输图中受伤，到实验很快死亡。剩余的146只经过一个多月的驯化饲养，野生瑶山亚种树鼩成活有135只：其中雄性67只、雌性68只。野生瑶山亚种树鼩成活率达到96%，经过驯化饲养后的野生瑶山亚种树鼩体重稳妥，基本极少出现死亡。说明相对于野外，实验室饲养提供的食物、环境能满足瑶山亚种树鼩的需求。经过4个月实验室饲养驯化，野生树鼩逐渐适应实验室喂食及饲养条件，整体体重基本趋于平稳。4.7.2瑶山亚种种树鼩基础种群的筛选瑶山亚种种树鼩基础种群的筛选是以建立瑶山亚种种树鼩封闭群为建群目标，2016年我们从野生驯化树鼩筛选出瑶山亚种种树鼩封闭群基础种群数量为152只，2017年3月抽样检测用了6只，2018年饲养过程中出现过疾病死亡11只，2019新引入61只，目前种群规模为196只（雄性90只、雌性106只），符合封闭群数量不能小于25对的要求；基础种群足够大可以有效地保持野生瑶山亚种树鼩遗传的多样性，能保存各种有价值或潜在有价值的基因，但成本投入巨大;基础种群者过小成本投入较小，但不排除有生物医学价值的性状随着基因的纯和而被剔除。因此，基础种群的大小应综合各种因素，建立最佳方案。5实验瑶山亚种树鼩的繁殖生长的研究5.1繁殖笼：8个不锈钢树鼩笼(400*550*600mm),每笼右侧带有一个PVC材质的休息箱（250*250*180mm），对待产的母树鼩，在其巢箱内放入高压灭菌过的稻草，供其做窝产仔及保温。5.2配种根据笼子大小我们的瑶山树鼩采用1：1的雌雄比例交配繁殖。选种好瑶山树鼩，把公树鼩和母树鼩从饲养笼一起移到繁殖笼中，母树鼩怀孕后繁殖笼中待产，移走公树鼩；2-6月份期间若是配对合笼一个月后不怀孕则拿出公母树鼩单独饲养，清理消毒繁殖笼1周后从新挑选公树鼩和母树鼩进行配对笼，其余月份期间则是配对合笼两个月后不怀孕从新配种合笼。刚开始配种合笼时要密切观察有无异常表现，若有异常，则应及时采取妥善处理措施。选配不当者及时调配，对咬伤情况早发现、早治疗，平时并向兽医报告。5.3怀孕检查雌雄瑶山树鼩合笼后，每周按时称重，若体重连续两周增加10g以上，腹部触诊可触及腹部膨隆，初步判断为母树鼩怀孕。体重连续增加的母树鼩，用手触摸检查2-3次以确定母树鼩怀孕妊娠，检查发现出母树鼩怀孕后雌雄分笼，留母树鼩在繁殖笼中待产。5.4种树鼩的饲养管理在树鼩日常饲养管理的基础上，配种合笼、妊娠期和哺乳期树鼩饲喂的基础饲料、苹果等果蔬要根据个体差异酌情增加饲喂量。下午16:30～17:30增加饲喂面包虫5-10g/天。做好分娩前准备，树鼩怀孕期45d～50d，分娩前10天左右应将棉布或稻草放入暗盒。5.5仔树鼩的哺乳与管理仔树鼩的哺乳：仔树鼩一般情况下由母树鼩母乳哺乳幼产，每天早晚2次观察幼仔情况，若发现幼仔爬出巢箱，及时将其放回，以防饿死或冻死；若发现有母树鼩咬死幼仔，则将被咬死的幼仔及时取出，并立即用清水洗消巢箱，注意动作轻柔，避免惊扰母树鼩及其他幼仔；若母树鼩母性不好，连续咬食幼仔，或不哺育幼仔，则取出幼仔行母树鼩被动哺乳，并配合喂食配方奶。仔树鼩环境条件的管理：保证树鼩幼仔成活的关键因素之一就是要全年保持饲养室温度在24～27℃，同时应注意夜间保温；重视饲养室的环境卫生，每天定时清洁、消毒笼具，按时更换、洗消喂食槽及饮水瓶；每天定时进入饲养室喂养、观察，减少工作人员的惊扰，保持饲养室内安静。5.6离乳及繁殖观察记录一般出生40～45天可以离乳，个别的可以延长到50天。离乳后离乳当天母仔分笼，可将母树鼩返回原笼；同一窝仔树鼩放在同一个笼中饲养。5～10天后再将同一笼中的仔树鼩分笼并编号，进行单笼单只饲养。给所有树鼩统一编号，记录雌树鼩的配种合笼日期、生产日期、每胎产仔数、哺育情况及时间、离乳成活数、后代雌雄数量及比例等，同时注意观察其饮食情况、母性好坏等，筛选出适合繁育的种树鼩，注意在观察时动作轻柔、安静，避免惊扰树鼩。5.7结果与分析5.7.1怀孕妊娠后母树鼩体重和饮食的变化怀孕妊娠后母树鼩体重的变化：统计分析了12窝怀孕妊娠母树鼩，体重最多增加65.8g，最低25.9g，平均49.25g。怀孕妊娠前二周，体重变化不大，从怀孕妊娠第三周起，树鼩体重呈现明显增加趋势，到生产前两周，体重增加更为显著，产前一周避免惊扰树鼩而影响其分娩不称重。至分娩前最后一次称重，最重的215.3g，最轻的168.65g，平均189.68g。怀孕妊娠后母树鼩饮食的变化：怀孕的前两周，孕期母树鼩食量变化不大，从第三周开始，孕期母树鼩食量逐渐增加，产前母树鼩食量下降。5.7.2受孕和生产情况经过挑选种树鼩，我们的瑶山种树鼩配对合笼共53次，母树鼩受孕13次，母树鼩配种受孕率24.53%，中途流产1只，未见死胎，顺利分娩12胎，本试验期总共产仔42只，每只雌树鼩受孕1～3次，每窝产仔3~5只，平均3.5只。树鼩怀孕期为39~63d，平均46.5d，分娩时间不固定。出生存活率92.86%，离乳存活率合计18只（42.86%，其中雄性8只、雌性10只）。结果表明瑶山亚种树鼩全年都可以配种繁殖，没有明显的季节影响，但是以4～6月繁殖最为集中，一年可以繁殖三胎。5.7.3哺乳期观察结果：幼仔初生体重为（12.4±1.6）g，刚出生的小树鼩全身无毛，闭眼，皮肤呈粉红色半透明状，可见大部分内脏器官，只会蠕动；第5～6天皮肤变黑，有皱纹；第8～13天长出黄褐色绒毛；第22～25天睁眼；第27～30天爬到巢箱外找寻食物；第35～40天可离开母亲独立生活，此时可断奶，分笼独自生活，幼仔离乳时最重的82.6g，最轻的51g，平均体重为68.67g。5.7.4瑶山亚种树鼩微卫星DNA的序列特征及遗传多样性分析：筛选出16对微卫星座位，可用于瑶山亚种树鼩的遗传多样性和遗传变异的研究：有7个位点TB2、TB10、TBC1、TBC3、TBC5、TG4和TG19在中缅树鼩瑶山、滇西亚种的种群中表现出不同的遗传多样性。它们能够准确地反映种系的遗传结构和种系间的相互关系，对用于两个亚种的鉴定具有重要意义；11