紫草多糖的体外抗氧化活性研究

紫草多糖的体外抗氧化活性研究刘婷，陈韩飞，赵文彬，李德芳，王振华，郑秋生，陈韩英【内容摘要】目的研究紫草多糖的体外抗氧化作用。方法通过·oh、dpph·、超氧阴离子、脂质过氧化及红细胞溶血反应体系，检测紫草多糖的抗氧化能力。均采取比色法测定。结果紫草多糖对·oh、dpph·、超氧阴离子、脂质过氧化及红细胞溶血均有去除或抑制造用。结论紫草多糖在体外具有抗氧化作用。【本文关键词语】紫草；多糖；抗氧化新疆紫草arnebiaeuchroma(royle)johns为紫草科软紫草属植物，又名新疆软紫草，收载于〔中国药典〕，是我们国家常用的中药［1］，多为草本，以根入药，因其根皮暗紫色，故名“紫草〞。该药具有凉血活血、解毒透疹之成效。已有研究表示清楚紫草具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及镇痛、抗肿瘤及免疫调节等生理活性［2］。现代医学证明，心脑血管疾病、衰老及肿瘤疾病的发生和发展与体内的活性氧自在基有亲密关系，而很多抗氧化成分能够去除这些自在基，阻断由它们引发的体内脂质过氧化，能够预防上述疾病的发生发展近年来，人们发现天然药物是极有潜力的抗氧化剂资源，从中寻找新的抗氧化剂是现代医药和保健操行业的发展方向。多糖是继黄酮类、多酚类、皂苷类及鞣质类之后从天然植物中发现的又一类抗氧化活性成分［3］。很多植物多糖对各种活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)具有去除作用，能减少脂质过氧化产品丙二醛(mda)的生成量，提升抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶sod、谷胱甘肽过氧化物酶gshpx等)，表现出多种途经的抗氧化作用［4，5］。研究多糖及其衍生物的抗氧化活性，对于开发出更多更好的天然抗氧化剂，逐步取代存在一定毒性、致畸性和潜在致癌性的化学合成抗氧化剂，具有主要的现实意义［6］。本实验研究紫草多糖的体外抗氧化活性。1材料与仪器1.1药材与试剂紫草，购改过疆阿克苏地区，枯燥粉碎过筛备用；1，1二苯基2苦肼基自在基〔sigma公司〕；tris(北京拜尔迪生物公司)；2硫代巴比妥酸〔上海科丰化学试剂〕；焦性没食子酸〔天津市富宇精细化工〕；其余试剂均为分析纯。1.2仪器多功能酶标仪〔thermo3001varioskanflash〕；ar2140型万分之一电子天平〔梅特勒托利多仪器制作〕；dl360超声波清洗机(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)。2方法2.1紫草多糖的制备称取100g紫草粗粉用600ml的石油醚〔30～60℃〕脱脂3次，晾干，然后参加1000ml蒸馏水提取数小时，趁热过滤，反复3次。合并水提液并浓缩至原体积的1/4，参加3倍量无水乙醇，静置过夜后抽滤。将沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，真空枯燥，即得粗紫草多糖。2.2多糖对·oh的去除作用［7］空白组：30μl0.75mmol/l邻二氮菲溶液中参加60μl0.15mol/l的pbs〔ph=7.4〕，参加30μl的蒸馏水，充足混匀后，参加30μl0.75mmol/l的硫酸亚铁，混匀后，再参加30μl的1%的h2o2混匀。37℃的水浴中60min后，在536nm处，测定吸光度为a1；空白对照组：以30μl的蒸馏水代替h2o2反复上述操作，在536nm处，测定吸光度为a2；样品组：以30μl的样品代替30μl的蒸馏水反复空白组操作，在536nm处，测定吸光度为a3；样品对照组：60μl0.15mol/l的pbs中加30μl的样品，充足混匀后，参加90μl的蒸馏水，在536nm处测定吸光度为a4；空白参比组：60μl0.15mol/l的pbs参加120μl的蒸馏水，在536nm处测定吸光度为a5。去除率〔%〕=［〔a3a4a1+a5〕/〔a2a1〕］×100%2.3多糖对dpph·的去除作用［8］向100μldpph·乙醇溶液〔浓度为0.2mmol/l〕中参加100μl紫草多糖溶液。涡旋振荡器混匀，室温，避光放置30min后，在517nm处测定吸光度，平行测定3次，并以一样浓度的维生素c作为阳性对照，计算去除率。去除率〔%〕=［a0〔a1a2〕］/a0×100%式中：a0为dpph·溶液100μl+无水乙醇100μl的吸光度；a1为dpph·溶液100μl+样品溶液100μl的吸光度；a2为样品溶液100μl+无水乙醇100μl的吸光度。2.4多糖对超氧阴离子的去除作用［9］取浓度为0.05mol/l的trishcl〔ph=8.2〕缓冲液100μl，25℃预热20min，参加50μl不同浓度的紫草多糖溶液，立即参加40μl的3mmol/l的邻苯三酚，振荡使之充足反应，4min后，用10μl的3mol/l的hcl终止反应，在325nm处测定吸光度〔a1〕，平行测定3次，并以一样浓度的维生素c作为阳性对照。模型对照组〔a0〕用50μl的蒸馏水代替样品液。空白对照组〔a2〕用40μl的蒸馏水代替邻苯三酚。抑制率〔%〕=［〔a0a1+a2〕/a0］×100%2.5多糖对卵黄脂质过氧化的抑制造用［10］卵黄悬液的配制：新鲜鸡蛋去卵清，卵黄用等体积的ph=7.4的0.1mol/lpbs配成1∶1悬液，并用磁力搅拌器搅拌10min〔置于冰箱中4℃〕备用，使用前用pbs稀释成1∶25的悬液。汲取1∶25的卵黄悬液20ml，参加20ml的不消浓度的紫草多糖溶液，再参加20ml的25mmol/l的feso4，用ph=7.4，0.1mmol/l的pbs补至200ml，37℃振荡15min，取出后再参加50μl的20%的三氯乙酸，4000r/min离心8min，汲取100ml上清液参加50ml0.8%tba，封口，沸水浴中煮15min，在532nm处测吸光度，平行测定3次，并以一样浓度的维生素c作为阳性对照。以不加样品管的吸光度为a0，以样品加pbs管的吸光度为a样。抑制率〔%〕=［〔a0a+a样〕/a0］×100%2.6多糖对红细胞溶血的抑制造用［11］小鼠摘眼球取血，参加肝素制成抗凝血，以4000r/min离心5min，再用预冷的生理盐水洗3次，制成0.5%的红细胞悬浮液。取红细胞悬浮液200ml，参加样品溶液40ml，最后参加0.1mol/l的h2o220ml，混匀，于37℃水浴中温浴60min，然后3000r/min离心10min，取上清液，用生理盐水稀释5倍，于415nm处测定吸光度〔以红细胞在超纯水中的溶血率为100%计算〕。抑制率〔%〕=〔a0a样〕/〔a0-a〕×100%式中：a0，h2o2诱导对照组吸光度；a样，样品组吸光度；a，正常组吸光度。2.7统计分析每次试验均设4个平行管，取平均值为1次试验数据，试验反复3次，采取spss10.0软件处理，所有数据均用±s表示。3结果3.1紫草多糖去除羟自在基的能力结果见图1。fenton反应是最常见的产生羟自在基的化学反应，h2o2的量和fenton反应产生的·oh的量成正比，当给予电子受体后，用gress试剂显色，构成红色物质，其呈色与·oh的量成正比关系。由图1可见，紫草多糖在实验浓度范围内对羟自在基的去除作用呈现出良好的量效关系，而且浓度越大，紫草多糖的去除羟自在基的能力越接近维生素c。3.2紫草多糖去除dpph·的能力结果见图2。人工合成的dpph是少数化学性质稳定的自在基之一，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收峰。当dpph·溶液中参加自在基去除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐步消失，其褪色水平与其承受的电子数成定量关系，因此可用比色法进行定量分析，评价样品的抗氧化能力［12］。从图2能够看出，紫草多糖具有较强的去除dpph自在基的能力，且随着样品溶液浓度的增长，去除率逐步增高，呈剂量依靠关系。3.3紫草多糖去除超氧阴离子的能力结果见图3。在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成o2·和有色中间产品，该有色物质在325nm处有一特征吸收峰。当参加去除剂时，o2·的生成遭到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在325nm处的吸光度减小。故通过测定a325值能够定量计算出去除剂的去除率［13］。实验结果〔图3〕表示清楚，紫草多糖、维生素c对超氧阴离子的生成均有去除作用，且随着浓度的增长作用加强。在较低浓度时，紫草多糖对超氧阴离子的去除作用强于维生素c。3.4紫草多糖对卵黄脂质过氧化的抑制造用结果见图4。卵黄中磷脂c2位上所含极低密度脂蛋白〔vldl〕和低密度脂蛋白〔ldl〕中的不饱和脂肪酸〔pufa〕在亚铁离子的催化下，能诱发过氧化，产生烷氧基〔ro·〕和烷过氧基〔roo·〕，进而引发链式反应。且在加热的条件下，其产生的过氧化物可与硫代巴比妥酸〔tba〕反应产生红色化合物，并在532nm处有最大吸收［14］。由图4可知，紫草多糖、维生素c对卵黄脂质过氧化的抑制造用呈剂量依靠性，且在一样浓度下，紫草多糖对脂质过氧化的抑制造用接近维生素c。3.5紫草多糖对红细胞溶血的抑制造用结果见图5。过氧化氢在体外诱导红细胞氧化而发生溶血，致使红细胞膜流动性降低，膜脆性增长，改变细胞膜的完好性，导致红细胞损伤，胞内物质外流。结果表示清楚，紫草多糖、维生素c均能降低h2o2诱导的红细胞氧化溶血率，溶血抑制率随着样品浓度的增大而增长，当浓度低于12.5mg/l时，紫草多糖与维生素c抑制溶血的能力相当。4讨论o2·、·oh及h2o2是生物体内重要的活性氧自在基，由它们引发的体内脂质过氧化是机体衰老、动脉硬化、心血管病及肿瘤发生的主要原因，而使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应,能够抑制机体的自在基损伤，进而坚持最佳健康状况和防治相关疾病，延缓衰老［15］。当前国内外也已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价，对保健食品的开发也具有积极作用［16］。我们的研究表示清楚，紫草多糖具有较强的去除羟自在基、dpph·及超氧阴离子和抑制卵黄脂质过氧化的作用，且呈剂量依靠性，其可能的作用机理如下：①紫草多糖能够捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行；②对于·oh而言，可快速地攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而紫草多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自在基，进一步氧化构成过氧自在基，最后分解成对机体无害的产品；③对于o2·，紫草多糖可与其发生氧化反应，最终到达去除的目的［17］。当前，对紫草多糖抗氧化的研究不够深切进入，抗氧化作用与多糖构造的关系仍不明确。除此之外，紫草多糖用于药理学实验的是一些粗制品，这使得要在分子水平上说明其药理作用和作用机制遭到了很大限制，有待于我们的进一步深切进入开展多糖的纯化以及抗氧化作用与其构效关系的研究。【以下为参考文献】1］国家药典委员会.中国药典［s］.北京：化学工业出版社，2005：238.［2］周延萌，高允生.中药紫草的药理作用与临床应用［j］.医药导报，2008，27(7)：786.［3］刘树兴，赵芳.从天然植物中开发抗氧化剂的研究进展［j］.食品研究与开发，2007，28(7)：179.［4］徐晓云，潘思轶，谢笔钧，等.沙棘籽原花青素体外抗氧化活性研究［j］.食品科学，2005，26(2)：216.［5］向志军，赵广荣，元英进，等.复方丹参的体外抗氧化活性研究［j］.中草药，2006，37(2)：211.［6］赵琳静，宋小平，黎方雅，等.多糖及其衍生物抗氧化性质的研究进展［j］.，2008，22〔1〕：44.［7］jinm.，caiy.x.，lij.r..，etal.1，10phenanthrolinefe2+oxidativeassayofhydroxylradicalproducedbyh2o2/fe2+［j］.progressinbiochemistryandbiophysics，1996，23：554.［8］rajbirsingh，sukhpreetsingh，subodhkumar，etal.studiesonantioxidantpotentialofmethanolextr