吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏超微结构影响的实验研究-图文

吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏超微结构影响的实验研究郭延军,石益海,陆淼,刘海燕,高秀丽,李秀梅,王莹(大庆油田总医院,黑龙江大庆163001摘要:目的探讨噻唑烷二酮类药物(TZD吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法建立STZ(链脲佐菌素诱导的糖尿病动物模型,随机分为正常对照组、正常对照治疗组、糖尿病组、糖尿病治疗组。结果糖尿病组肾重/体重显著高于正常对照组及正常对照治疗组(P<0105,而糖尿病治疗组显著低于糖尿病组(P<0105。各组肾小球内细胞外基质蓄积、基底膜增厚及肾小球系膜细胞增生指标,糖尿病组均高于正常对照组、正常对照治疗组和糖尿病治疗组(P<0105经TZD治疗后可减轻。结论TZD类药物可以抑制大鼠糖尿病肾小球系膜细胞增生、基底膜基质合成以及肾小球内细胞外基质蓄积,对糖尿病大鼠肾脏有保护作用。关键词:医学实验动物学;噻唑烷二酮类药物;糖尿病肾病;动物模型学科分类代码:3101440中图分类号:R36111文献标识码:A文章编号:1004-5775(200503-0180-05ExperimentalStudyonAffectionofUltra-microstructureofRatDiabetesKidneyTreatedwithPioglitazoneGUOYan-jun,SHIYi-hai,LUMiao,etal.(TheGeneralHospitalofDaqingOilfield,Daqing163001,ChinaAbstract:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsandthemechanismofthiazolinedineonkidneyofdia2beticrats.MethodsTheanimalmodelwasinducedbySTZ.Wistarratsweredividedintonormalcontrolgroup(Agroup,normaltherapygroup(Bgroup,diabeticcontrolgroup(Cgroupanddiabetictherapygroup(Dgrouprandomly.ResultsThekw/bwingroupCwashigherthangroupAandB(P<0.05.ButitwasloweringroupDthangroupC.Theaccumulationofextracellularstroma,thicknessofbasemembraneandproliferationofmesentericcellingroupCwerehigherthanthoseinothergroupsbutcoulddecreaseafterTZDtreatment.ConclusionTZDdrugscouldinhibitaccumulationofextracellularstroma,thicknessofbasemem2braneandproliferationofmesentericcellsothattoprotecttheratkidney.Keywords:TZD;Diabeticnephropathy;Animalmodel目前,对糖尿病肾病(DN的发病机制尚不清楚,而且对DN缺乏非常有效地干预手段。有研究表明,胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(TZD作为PPAR-γ的配体,不但可以改善糖代谢,尚可减轻胰岛素抵抗,改善β细胞功能和血脂紊乱〔1,2,3〕,个别报道TZDs对糖尿病慢性并发症也有一定疗效〔3〕。为此,本实验采用单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ诱发大鼠DN的动物模型,拟观察DN的大鼠肾脏超微结构改变,为DN的防治提供新方法和实验依据。1材料与方法111材料11111主要试剂:链脲佐菌素(STZ:购于sigma公司;Wistar大鼠:由吉林大学动物实验中心提供,全部雄性;TZD(盐酸吡格列酮:购于北京太平洋药业有限公司,每片15mg。11112主要仪器:透射电子显微镜:JEM-1200EX型,日本;光学显微镜及摄像系统:Olympus,日本。112方法11211糖尿病动物模型的建立健康雄性Wistar大鼠购自吉林大学实验动物中心,鼠龄12周,常规饲养1周后,称重。体重182~301g,平均体重235g,按于德民等方法建立STZ糖尿病模型〔4〕。采用0.1mmol/L枸椽缓冲液配成的1%链脲佐菌素(STZ溶液,以55mg/kg体重单次腹腔注射STZ,72h后剪断尾尖用血糖仪测血糖,凡血糖浓度≥16.67mmol/L作为糖尿病大鼠。实验期间动物自由饮水、饮食,未使用胰岛素及其他降血糖药物。11212动物分组健康雄性大鼠随机分为两组,包括正常对照组(NC,正常对照治疗组(NCT;雄性成模糖尿病大鼠随机分为两组,包括糖尿病组(DM,糖尿病治疗组(DMT。每组10只。11213观察指标各治疗组于成模3d后给药,TZD类药物成人剂量15~30mg/d,大鼠所用剂量为成人治疗剂量的25~50倍。吡格列酮药物配成溶液,每天15:00灌胃1次。DMT组及NCT组均给予盐酸毗格列酮3mg/kg,NC组仅给予等量生理盐水灌胃。每周称重以及测血糖1次。在实验12周末,分别将50只大鼠处死后迅速取出双肾,滤纸吸干称重,一侧肾脏放入10%福尔马林固定液中,以备用免疫组织化学检查;另一侧肾脏取一部分皮质放入215%戊二醛固定液,用作电子显微镜检查,剩余部分肾脏置于-180℃液氮中以备提取RNA。11214测定方法1121411肾重/体重(肥大指数:电子称上面放一滤纸,然后将一肾脏放在上面称重所得数据与大鼠平均体重进行比较,即为肾脏肥大指数。1121412肾小球平均截面积、基质基底膜面密度、毛细血管袢面密度:用PAS染色法,采用肾小球图象分析肾脏疾病资料管理系统测定。将PAS染色的肾组织切片置光镜下,放大40倍,图像摄入医用图像处理系统(TJTY-300。检测皮质区经肾门正切的5个肾小球,计算肾小球截面积。检测每份标本10个肾小球,计算肾小球基质、基底膜与系膜区面积比为基质基底膜面密度。检测每份标本10个肾小球,计算毛细血管袢与系膜区面积比为毛细血管袢面密度。以上均取平均值。1121413肾小球细胞总数:用于光镜的肾组织标本用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,4μm切片作PAS染色,选直径为80~100μm,平均数为20个肾小球,采用直接计数法计数每1个肾小球横截面阳性细胞核总数(细胞核数少于50的肾小球删除〔5〕,取平均值,但多形核以及一些退变细胞核的碎片除外。1121414基底膜厚度(电镜下观察肾脏超微结构:(1固定:标本立即放入2.5%戊二醛固定液中,并置入4℃冰箱中进行前固定,前固定4h后,更换成0.05M磷酸缓冲液。最后以1%锇酸固定液于室温中进行1h后固定。(2脱水和包埋:①首先依次用50%→70%→95%无水酒精进行脱水,在每种酒精中停留30min;②用氧化丙稀透明3次,每次10~15min;③氧化丙稀与Epon812工作液等量混合,对组织进行浸透;④新鲜配制的Epon812工作液包埋组织数小时,使之逐渐固化;⑤将包埋组织的Epon812固化块逐渐加高温度(不超过60℃,使之聚合变硬,最后呈黄色透明状。(3切片:LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片,醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色,JEM-1200型透射电镜观察摄片。各组大鼠电镜图像摄入医用图像处理系统计算基底膜厚度。113统计学处理应用SPSS10统计软件做数据处理分析。计量资料以均数±标准差表示(x±s,多组间比较用方差分析,P<0105有显著性差异。2结果211TZD对各组血压、血糖、肾重/体重(肥大指数、24h尿蛋白定量的影响(见表1。表1各组大鼠一般资料(x±s组别实验周期(周鼠数(只血压(kPa血糖(mmol/L24h尿蛋白定量(g/L肾重/体重(‰正常对照组12101514±1164197±013601012±010063166±0123正常对照治疗组12101512±1175128±013801013±010073160±0153糖尿病组12101512±21426188±319#301026±01013#34177±0125#3糖尿病治疗组12101610±11422193±4159#301016±0109#3△3180±0190#3△注:与正常对照组比较,#P<0105;与正常对照治疗组比较,3P<0105;与糖尿病组比较,△P<0105212TZD对糖尿病大鼠肾脏病理形态学的影响21211图1所示:为正常对照组(NC大鼠肾组织结构PAS染色情况,可见有许多袢状毛细血管,这些毛细血管盘绕成5个毛细血管小叶或节段,小叶内的毛细血管之间有系膜组织相连接,毛细血管之间的吻合支很少。毛细血管腔无压迫现象,系膜宽度未超过毛细血管直径。肾小管细胞的游离面有发达的刷状缘,PAS染色呈深红色,管腔面规则,胞质细颗粒状,胞核圆形,染色质细腻。21212图2所示:为糖尿病组大鼠肾组织结构PAS染色情况,可见系膜增生,增生的系膜组织对肾小球毛细血管袢有明显压迫现象和破坏作用,受挤压的毛细血管出现萎陷乃至消失,系膜宽度略超过毛细血管直径,呈弥漫分布。21213图3所示:为正常对照组大鼠肾组织电镜超微结构,电镜下可见足细胞从胞体伸出几个大的突起,在依次分出次级突起。足突相互形成指状相嵌的交叉状,呈薄片状与基底膜相接触。足突分布均匀,无融合及假绒毛样改变现象。肾小球毛细血管基底膜位于内皮细胞和上皮细胞之间,是一层连续的半透膜。可见基底膜均匀一致,内疏松层、中间的致密层和外疏松层光滑,无电子致密物沉积。21214图4及图5所示:为糖尿病大鼠肾组织电镜超微结构,电镜下可见系膜区系膜基质增生,系膜细胞轻度增生。图1正常对照组大鼠肾组织结构PAS(×4002糖尿病组(DM大鼠肾组织结构PAS染色(×400图3电镜下正常对照组大鼠肾组织超微结构(×60004电镜下糖尿病组大鼠肾组织超微结构a(×5000图5电镜下糖尿病组大鼠肾组织超微结构(×10000图6电镜下糖尿病治疗组大鼠肾组织超微结构(×10000上皮细胞的足突轻度融合,使原来附于基底的排列有序的足状突起代之以带状结构,贴敷于基底膜上。毛细血管基底膜局部增厚,基底膜样物质均匀增多,基底膜的微细结构消失。毛细血管内皮细胞核染色质趋边凝聚。21215图6所示:为糖尿病治疗组大鼠肾组织电镜超微结构,电镜下可见系膜区无系膜基质增生,无系膜细胞增生。上皮细胞的足突融合减轻,毛细血管基底膜无增厚。213各组大鼠肾组织形态学指标(12周后肾脏病理参数比较21311各组大鼠肾组织基质基底膜面密度、肾小球平均截面积、毛细血管袢面密度比较(见表2表2各组大鼠肾小球形态学指标(12周后肾脏病理参数比较(x±s组别鼠数(只基质基底膜面密度肾小球平均截面积毛细血管袢面密度正常对照组100127±010*******±711100173±0105正常对照治疗组100125±010*******±61160175±0105糖尿病组100176±0111#3489142±13145#3015±0107#3糖尿病治疗组100128±0104△288130±8102△0176±0103△注:与正常对照组比较,#P<0105;与正常对照治疗组比较,3P<0105;与糖尿病组比较,△P<010521312各组大鼠肾组织肾小球内总细胞数的比较(见表3表3各组大鼠肾小球内总细胞数(x±s组别鼠数(只检测肾小球数(个肾小球平均细胞总数(个/肾小球横截面正常对照组102081180±11102正常对照治疗组102072198±9131糖尿病组1020100137±9188#3糖尿病治疗组102082116±3145△注:与正常对照组比较,#P<0105;与正常对照治疗组比较,3P<0105;与糖尿病组比较,△P<010521313电镜观察各组大鼠肾组织肾小球基底膜厚度(见表4表4电镜观察各组大鼠肾组织肾小球基底膜厚度(x±s组别鼠数(只肾小球基底膜厚度(μm正常对照组101162±0124正常对照治疗组101176±0112糖尿病组102166±0137#3糖尿病治疗组101171±0114△注:与正常对照组比较,#P<0105;与正常对照治疗组比较,3P<0105;与糖尿病组比较,△P<01053讨论糖尿病肾病(DN的预后多数不良,已成为糖尿病病人主要的死亡原因。这主要是因为其肾脏病变是慢性进行性损害,临床症状出现较晚,一般出现尿蛋白时,病程多在10年以上。另外,一个重要原因是糖尿病引起肾脏损伤的主要机制尚不清楚,而且目前缺乏有效地防治药物,以减缓肾脏的损害〔4,5,6〕。有研究表明,形成DN的多种机制可能与以下几个方面的因素有关。其中包括循环障碍、肾血流动力学异常,以及遗传易感因素等。但其确切机制目前未完全明了,仍需实验,以进一步阐明DN发病机制。最近新一代噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂—盐酸吡格列酮,成为新世纪治疗糖尿病的一类新药。但它是否对DN有防治作用以及其作用机制,目前尚不完全清楚。本实验采用单次腹腔注射STZ制成1型糖尿病模型〔7〕,经用盐酸毗格列酮给大鼠灌胃治疗,观察治疗DN的疗效,并探讨其作用机制。本实验发现糖尿病组大鼠肾重/体重之比(肾脏肥大指数明显高于正常对照组及正常对照治疗组,提示糖尿病肾脏肥大,与文献报道一致〔8,9〕。经PAS染色发现,DN病变主要发生系膜区。肾小球系膜扩大,肾小球总数增多,系膜增生,增生的系膜组织对肾小球毛细血管袢有明显压迫现象和破坏作用,受挤压的毛细血管出现萎陷乃至消失,系膜宽度略超过毛细血管直径,以上说明肾小球系膜出现病变,为中度系膜增生。毛细血管袢面密度减少,而且肾小球平均截面积增大,电镜还发现系膜细胞增生、细胞外基质堆积、基底膜增厚。这些形态学改变的结果,一方面再次证明DN模型成功,另一方面也证明了DN发病的机制,可能是由于肾小球系膜细胞增生及细胞外基质堆积,肾小球系膜扩大,从而发生以下几种情况:(1对肾小球毛细血管袢失去支持和保护作用;(2系膜区是血浆大分子物质的转运通道,系膜区发生病变后,不能或不易通过滤过屏障的大分子物质以及沉淀于毛细血管壁的特殊物质(免疫复合物等,均不能通过系膜细胞间隙或系膜通道进入淋巴管和血管,或通过血管壁进入肾小管;(3系膜细胞具有平滑肌细胞的结构和功能,并有血管紧张素Ⅱ(AngiotensionⅡ的受体,使之收缩,而对前列腺素E2也较敏感,使之舒张,系膜细胞增生后,系膜细胞的收缩与舒张失调,调节肾小球的血流状态发生紊乱,并使系膜细胞间隙或系膜通道的体积变化受阻,从而影响血浆和大分子物质的肾小球内移动;(4系膜细胞增生,则产生大量的系膜基质或基质样物质,使基底膜增厚;(5增生的系膜细胞可产生大量的胶原纤维和基质;(6系膜细胞增生可产生多种细胞因子,使系膜增生及肾小球动脉硬化,最终出现糖尿病肾脏肥大〔10,11〕。经TZDs类药物治疗后,肾脏肥大指数下降,糖尿病组细胞外基质明显减少,肾小球基底膜厚度明显减少,肾小球总数减少,肾小球系膜细胞增生减轻。这些形态学实验结果也证明了TZDs类药物对DN有治疗作用,其机制可能是TZDs类药物直接作用于肾小球细胞,抑制肾小球细胞增生及细胞外基生精冲剂对精索静脉曲张大鼠睾丸组织抗过氧化损伤的实验研究安立文,隋勇,侯高峰(黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江哈尔滨150040摘要:目的探讨生精冲剂对精索静脉曲张睾丸中超氧化物歧化酶(SOD、过氧化氢酶(CAT、血管紧张素转化酶(ACE活性及脂质过氧化物(LPO、一氧化氮(NO含量的影响。方法测定治疗组大鼠睾丸中SOD、CAT、ACE活性及LPO、NO含量与模型组的差别。结果治疗组大鼠睾丸中SOD、CAT、ACE活性高于模型组,LPO、NO含量低于对照组(P<0101。结论生精冲剂对精索静脉曲张生成的睾丸脂质过氧化损伤具有保护作用。关键词:药理学;生精冲剂;精索静脉曲张;睾丸损伤;SOD;CAT;ACE;LPO;NO学科分类代码:31014410中图分类号:R285文献标识码:A文章编号:1004-5775(200503-0184-02ExperimentalStudyonAnti-peroxidationInjuryofShengjingInstantPowderforTestisTissueofVaricoceleofRatANLi-wen,SHUIYong,HOUGao-feng(TheFirstAffiliatedHospitalofTCMUniversityofHeilongjiang,Harbin150040,ChinaAbstract:ObjectivetostudythechangeoftheactivityofSOD,CAT,ACEandthecontentofLPO,NOinvaricoceletestisinducedbyshengjinginstantpowder.MethodsToassaythecontentofLPO,NOandtheactivityofSOD,CATandACEinvaricoceletestis.ResultsTheactivityofSOD,CATandACEwashigherincure-grouprattestisthanthatinmodel-group.OnthecontrarythecontentofLPOandNOincuregroupwaslower.ConclusionShengjingin2stantpowdermightprotectthetestisfrontheinjuryoflipidperoxidationinvaricocele.Keywords:Shengjinginstantpowder;Varicocele;Testisinjury;SOD;CAT质堆积,保护肾小球滤过膜的电荷和分子屏障,阻止蛋白的滤出,从而发挥降低尿蛋白作用,进而促进肾小球系膜损伤的修复。TZD对人类DN的治疗效果还有待于更多的临床研究。本实验为临床的应用提供了可靠的实验依据。参考文献:〔1〕SaltielAR,OlefskyJM.Thiazolidinedionesinthetreatmentofinsulinresistanceandtype2dia2betes〔J〕.Diabetes,1996,45:1661.〔2〕SpencerCM,MarkhamA.Troglitazone〔J〕.Drugs,1997,54:89~101.〔3〕NolanJJ,LudvikB,BeerdsenP,etal.Im2provementinglucosetoleranceandinsulinresistanceinobesssubjectstreatedwithtroglitazone〔J〕.NEnglJMed,1994,331:1188~1193.〔4〕于德民,吴锐,尹潍,等1实验性链脲佐菌素糖尿病动物模型的研究〔J〕1中国糖尿病杂志,1995,3(2:1051〔5〕莫敬浑,王键,张凯珍,等1Ⅱ型糖尿病人