二氢嘧啶脱氢酶活性及氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用

二氢喀噬脱氢酶活性及5-氟尿喀噬活性代谢产物测定及其临床应用■山东大学齐鲁医院临床药理研究所李平利张蕊郭瑞臣5-氟尿喀噬(5-FU)及其前体药物卡培他滨临床常用于乳腺癌、结直肠癌及头颈癌等多种月中瘤的治疗。5-FU进入机体后,80犯上经肝脏二氢喀噬脱氢酶(DPD代谢并转化为氟代B-丙氨酸(FBAL,FBAL的代谢产物为氟乙酸(Fluoroacetate)和氟代柠檬酸(F-citrate),是引起5-FU心脏及神经毒性的主要活性物质。部分未经DPD弋谢的5-FU在体内转化为具有生物活性的FUTP和FdUTP通过干扰月中瘤细胞RNA|£DNA勺生物合成发挥抗月中瘤作用，或转化为FdUMP与胸甘酸合成酶(TS)、5,10-亚甲基四氢叶酸(CH2THF形成稳定的三联复合物，抑制TS正常功能，干扰DNA^成，发挥DN协导的细胞毒性作用(如图所示)。DPDS因(DPYD存在多态性，不同个体间DPD舌性差异较大，甚至部分或完全缺失。DPD?分或完全缺失个体，5-FU常规剂量可导致消除率降低，发生5-FU相关毒性，如粘膜炎、粒细胞减少症、神经性病变，甚至死亡。而DPDS表达个体,则造成5-FU耐受，常规剂量难以达到理想治疗效果。由于DPYDS因存在多个突变位点，或可能存在未知位点，或某些位点功能活性的研究尚不完全，导致已知DPYDS因突变与DPDft型缺乏一致性。因此，DPD舌性测定对于5-FU个体化治疗更具重要意义。其他参与5-FU体内生物转化的尿昔磷酸化酶、乳精酸磷酸核糖转移酶、胸甘磷酸化酶等的基因型及活性不同个体间也不完全相同，使产生活性代谢产物FUTPFdUTPFdUMP勺量存在差异。而FUTPFdUTPRFdUMPI杀伤月中瘤细胞的直接作用形式，故测定其细胞内浓度可更直接地揭示或预测5-FU的疗效或毒副作用。因此，直接或间接测定DPD舌性及5-FU活性代谢产物水平有助于制订、调整、修饰5-FU的给药方案，提高疗效，降低毒副作用，并进一步评价常规5-FU浓度测定的优势和局限性，明确5-FU发挥药效或产生毒副作用的机制。DPD活性测定DPD舌性测定包括表型测定(Phenotype)、基因型测定(Genotype)、蛋白表达及mRNAK平测定。DPD表型测定

表型指在环境影响下基因型所发生的机体的物理表现和可见性状，不同表型药物代谢酶的催化代谢活性大小，可通过测定其底物的代谢率断定。底物可以是外源性探针药物，如异烟肌、氨苯碉、咖啡因等可用于测定N-乙酰基转移酶表型测定，非治疗目的，一次性服用；也可以是治疗药物，如5-氟尿喀噬，以原形与代谢物比值表示相关酶活性的强弱。DP说布于人体多个组织、器官，但主要存在于肝脏，参与80犯上5-FU的肝脏代谢。测定血浆或尿液二氢尿喀呢（UH2、尿喀噬（U）、二氢胸腺喀呢（THY2、胸腺喀呢（THY、二氢氟尿喀噬（5-FUH2、氟尿喀噬（5-FU）浓度，计算UH2/UTHY2/THY5-FUH2/5-FU值可间接反映DPD舌性。BenFredj等采用高效液相色谱-紫外方法测定9例接受5-FU/亚叶酸钙化疗的晚期结直肠癌患者血浆UH2fU峰面积，计算所得UH2/Ufi范围为0.07〜3.12。该比值与相应5-FU血浆半衰期呈负指数相关，与患者5-FU毒性相关。Serdar等采用LC-MS/MSW定45例接受5-FU治疗患者PBMC的5-FUH2和5-FU浓度，计算得5-FUH2/5-FU值为21.9±3.72,2例DPD^失患者分别为1.26和1.61,说明DPD舌性缺失可使5-FU的消除率严重降低。VanKuilenburgAB等以放射性[4-14C]THY为底物，采用反相高效液相色谱方法检测THY及其降解产物THY2ft度，以每毫克蛋白每小时代谢生成的THY2nmol数表示DPD舌性。结果显示，2例5-FU治疗出现严重毒性反应的癌症患者PBMCsDP活性分别为3.2nmol-mg-1-h-1和4.2nmol-mg-1-h-1,低于健康志愿者平均DPD舌性水平。其中1例患者治疗后康复期DPD舌性恢复到正常水平（8.6nmol•mg-1•h-1）。进一步研究显示，44例接受5-FU/亚叶酸钙化疗患者PBMC即DPD舌性在4.2〜16.0nmol•mg-1-h-1范围内呈高斯分布，较低DPD活性与中性粒细胞减少症显著相关，但与胃肠道反应、流感样症状、手足综合征等毒副反应无相关性。Btchel等采用LC-MS/MSJ法测定10例结直肠癌患者接受5-FU治疗前内源性血浆UUH2及接受5-FU治疗2h后外源性5-FU、5-FUH2浓度。结果显示，U和UH2ft度范围分别为（0.07〜2.6）和（0.81〜1.77）MUH2/U®为3.7〜15.4;5-FU和5-FUH2浓度范围为（1.4〜6.7）和（9.1〜25.8）由于DPD可能存在饱和状态，接受5-FU治疗后，即体内有5-FU存在时，U和UH2ft度高于接受5-FU治疗前，即体内不存在5-FU时。Sistonen等认为，多数个体，接受5-FU治疗前的UH2/U值为DPDt饱和状态时的活性，不能准确反映DPD舌性

变化，而5-FU治疗期间所得UH2/U值更准确。因此，接受5-FU治疗前给予一定量DP陈物（如U）,所得UH2/U值可更准确评估DPD舌性，并准确预测5-FU相关性毒性。另外，由于5-FU可被DPD弋谢为FBALFBAL7K平也可一定程度上反映DPD活性。有报道采用RP-HPLCt测定体外细胞内经DP防解的5-FU代谢物FBAL浓度，或采用LC-MS/MSt测定职业暴露于5-FU人员尿液FBAL浓度，可用于监测、评价医护人员暴露于5-FU的风险，也可用于DPD舌性测定。采用探针药物间接测定DPD舌性，包括其他药物代谢酶，快速、简便，易于推广，但探针药物须代谢机制清楚，代谢途径单一；排除其他疾病、年龄因素影响；原形和代谢物浓度测定方法应灵敏专一。DPYD基因型测定已知DPYDS因存在30多种单核甘酸多态性及缺失突变，包括DPYD*2ADPYD*1转，可造成DPD舌性降低或缺乏。不同的基因位点突变对DPD舌性影响不同，因此，明确DPYDS因型与活性之间的相关性可用于指导5-FU剂量方案调整。DPYD*2胶变导致第14位外显子缺失，造成DPD舌性降低甚至丧失。一项Meta分析结果表明，DPYD*2胶变与5-FU相关毒性反应（》3级）密切相关（OR5.42,P<0.001）,须将5-FU或卡培他滨初始给药剂量降至标准剂量的50%以降低DPYD*2胶变携带者发生严重毒性反应的风险。Henricks等认为，DPYD*2A纯合突变个体，不建议给予5-FU类药物。杂合突变个体DPD舌性P1低50%c.2846A>T纯合突变个体降低50%杂合突变个体降低25%可采用荧光原位杂交、基因测序等技术分析DPYDS因多态性，根据患者基因型预测DPD舌性及DPD代谢5-FU的能力，高效、简便，可用于5-FU的个体化治疗。但由于体内处置过程的复杂性和未知基因突变位点存在的可能性，以及已发现突变位点与酶活相关性有待证实，通过基因型预测酶活性尚有一定局限性。DPD蛋白及mRNA<平测定DPDmRNA平与DPD舌性密切相关，月中瘤组织或细胞DPD舌性可预测5-FU的治疗效应和毒性效应。因此，也可采用免疫组化或逆转录聚合酶链反应（RT-PCR方法测定月中瘤组织DPCg白表达，预测DPD舌TtoKim等测定184名

胃切除术并替吉奥（S-1）辅助化疗的胃癌患者月中瘤组织DPD®白表达及mRNA水平，单变量或多变量分析表明，月中瘤组织DPDS白表达量或mRNAK平较低患者，5年无病生存期（DFS差，更易发生非血液学毒性（》3级）反应。但月中瘤组织DPDmRNAS表达患者，对以5-FU为基础的化疗方案则产生较差的治疗效果。提示，DP讣仅影响5-FU及含5-FU药物治疗方案的治疗效应和毒性作用，还影5-FU活性代谢产物测定由于细胞内活性代谢物含量较低，细胞转运蛋白外排作用的程度难以确定，代谢物与内源性核甘酸结构高度类似存在干扰，较难准确测定。但FUTPFdUTPFdUMRft为5-FU细胞内发挥抗月中瘤作用的活性物质，细胞内水平直接反映到达作用部位的量，对于指导5-FU剂量方案调整，阐述耐受机制，有不可替代的作用。因此，应建立准确、可行、实用的体内FUTRFdUTPFdUM水平测定方法。Carli等采用固相提取法，对极性化合物有较长保留时间的AtlantisC18色谱柱，流动相为甲酸俊（5mMpH4）/甲醇/水（5/5/90,v/v）,等离子梯度洗脱，三重四级杆质谱检测器定量测定MCF-7细胞内5-FdUMP（ng/pg蛋白）。结

果显示，5-FU孵育后30min内，细胞内5-FdUMP勺量呈线性增加。操作简便，可用于生物样本5-FdUMp佥测。Derissen等建立了UPLC-MS/MS法测定接受5-FU治疗患者PBMC即FUTRFdUTRFdUMFPT量。采集患者16ml外周血，提取白细胞，甲醇裂解后取上精液进样。3例口服卡培他滨及5例接受FOLFOX觥疗方案治疗的癌症患者PBMC即FUTPFdUTPFdUMPffl定结果显示，卡培他滨给药后0〜8h内，测得FUTPft低浓度为1.84nM,但未测出FdUTPf口FdUMP同样，静脉注射5-FU患者，测得FUTP最低浓度为178nMFdUMP1低浓度为3.39nM,但未测出FdUTP提示该方法特异、灵敏，但需进一步优化，或扩大样本，提高研究方法的适用性，以实现对生物样本FUTPFdUM刖FdUTP勺定量检测以及临床实用价值的评价。展望DPDB在5-FU化疗过程中发挥着重要的作用，掌握其生理病理特点、作用规律和影响因素有助于提高5-FU的疗效，降低其毒副作用。虽然DPYDS因多态性检测已被推荐用于预测5-FU类化疗药物的毒性及敏感性，5-FU浓度测定也被常规用于治疗药物监测，但作为补充，DPDB活性测定可更全面反映由未知基因突变或非基因因素造成的DPD舌性改变，并作为制定、调整、修饰5-FU治疗方案的依据，提高5-FU治疗的有效性和安全性。止匕外，尽管DPD舌性研究已较为深入，但由于研究者的角度不同，如样本来源，体内体外研究，采用的方法不同，如色谱法、光谱法、免疫法等，或样本量的局限性，导致DPD舌性缺乏统一的界值，即低于界值患者更大可能出现高风险毒性反应，从而需要规范设