大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化课件

大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化

WK2009.11.11基本原理感受态（Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA的状态转化（transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程（常规转化、非常规转化）致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落转化的确切机制还不清楚外源基因导入受体细胞：CaCl2处理后的细菌转化或转染高压电穿孔聚乙二醇介导的原生质体转化原生质体融合细胞核的显微注射颗粒轰击技术制备感受态细胞：CaCl2法、RbCl(KCl)法、电转化法、Inoue法、上海生工的试剂盒制备

基本步骤感受态细胞的制备：从-80°冰箱取出一管DH5ά菌种，接种环接菌划于37°C预热的无抗生素的LB平板，37°C过夜；挑取单克隆第二次划板（注意：三步法划板，每划完步后，接种环必须在酒精灯上烧一下，以免菌太多，且必须冷却以后在进行下一步）；从培养皿上挑取一单菌落与3-4mlLB培养液中（无抗生素），37°C摇床过夜（如需要可以挑一管含抗生素的作为对照）；将菌液倒入500mlLB培养液中（无抗生素），37°C，250rpm培养至OD=0.375（注意：事先准备还200µlLB培养液做对照，细菌OD值非常重要，1-1.5个小时以后要开始测细菌浓度，细菌OD值最好不要超过0.4）；取800µl菌液到无菌的甘油管中保存菌种，余下的分装到6个无菌100ml离心管，置于冰上30min；2000g，4°C离心10min；弃上清，每管加入10ml过滤灭菌的Cacl2重悬细菌，轻轻吸打沉淀，直至完全分散，置于冰上30min，也可以把6管合成2管，但是Cacl2的量仍为60ml；1500g，4°C离心8min，弃上清，重悬10×6=60mlCacl2中，用枪轻轻吸打沉淀，直至分散，放置冰上30min；1500g，4°C离心8min，弃上清，重悬于20mlCacl2（10ml×2），置于冰上30min；、接每管100µl分离至-20°C预冷的无菌1.5mlEP管中，然后马上置于-80°C保存。注意：以上制备感受态细胞的实验过程一定要在无菌环境中，冰上操作！！！转化及复苏

1、从-80°C冰箱拿出一管保存的感受态细胞放置与冰上解冻，将所需的培养平板倒置于37°C培养箱；

2、加10µl质粒到感受态细胞中（不要打匀），冰上放置30min；

3、冰上放置过程中准备超净工作台，移液器及枪头等均需照射紫外，准备42°C水浴锅；

4、420C循环水浴热激90秒

5、冰浴2分钟

6、每管加800uLLB液体培养基，370C慢摇1小时（150rpm）

7、100uL或50uL已复苏的感受态细胞，涂布在含Amp的培养皿中，涂匀

8、倒置培养过夜（370C）影响转化效率的因素细菌的生长状态(5x107个/mL)试剂的质量感受态细胞的质量外源DNA的质量与数量器皿的洁净度污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hs