第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵与酿造中

第三章

微生物的代谢调控理论及其在食品发酵与酿造中的应用

本章主要内容第一节微生物的代谢与调节的生化基础一、初级代谢和次级代谢二、代谢调节的部位三、与代谢调节有关的酶第二节微生物代谢的协调作用一、诱导作用二、分解代谢物的调节三、反馈调节四、能荷调节第三节代谢控制在工业发酵中的应用一、发酵工艺条件的控制二、菌种遗传特性的改变三、控制细胞膜的渗透性第一节微生物的代谢与调节

的生化基础

1.代谢概述①新陈代谢：发生在活细胞中的各种分解代谢和合成代谢的总和，即：新陈代谢=分解代谢+合成代谢。新陈代谢又可分为初级代谢和次级代谢。②分解代谢是指把复杂的有机物分子分解成简单的化合物，并释放能量的过程。一、初级代谢和次级代谢

③合成代谢是指由简单化合物合成复杂的大分子的过程。④初级代谢是指微生物的生长、分化和繁殖所必需的代谢活动。

⑤次级代谢是指非微生物生命活动所必需的代谢活动。2.初级代谢产物①定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。②举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。③特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的。3.次级代谢产物①定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。②举例：抗生素、毒素、激素、色素等。③特征：不同的微生物次级代谢产物不同；微生物生长到一定阶段才产生。

二、代谢调节的部位生物体的新陈代谢活动都是在细胞内进行的每个细胞内分子都不是独立的，而是相互联系分工合作，实际是像一个有一定组织结构的加工厂。细胞工厂的基本机件是生物催化剂—酶微生物细胞体内具有一整套精确、合理、经济、高效的代谢机构。生物体有自我调节的能力。近年来对生物细胞的研究表明：微生物代谢过程的自我调节表现在控制营养物质进入细胞，酶与底物的接触和代谢物的流向等三个环节上。许多化合物代谢所在的部位是受到控制的：（P51图3-1）

1、通道

2、通量

3、限制其基质有形接近三、与代谢调节有关的酶与微生物代谢调节有关的酶有同功酶、别构酶、多功能酶。指具有不同分分子结构但催催化相同反应应的一组酶。。不同点：体外外：理化性质质体内：催化特特性、分布的的部位、生物物学功能每组同工酶中中各种酶的异异同：相同点：催化化相同的化学学反应,大多数是寡聚聚酶。同工酶的定义义：（一）同功酶酶（一）同工酶酶同工酶的作用用：对于适应不同同的组织、器器官的不同生生理需要非常常重要；是代代谢调节的一一种重要方式式，它的主要要功能在于其其代谢调节。。同功酶调节同功酶的主要要功能在于其其代谢调节，，在一个分支支代谢途径中中，如果在分分支点以前的的一个较早的的反应是由几几个同功酶所所催化时，则则分支代谢的的几个最终产产物往往分别别对这几个同同功酶发生抑抑制作用。例如，大肠杆杆菌以天门冬冬氨酸为前体体合成苏氨酸酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中中有三种天门门冬氨酸激酶酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨氨酸脱氢酶的的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、、异亮氨酸的的反馈抑制和和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的的反馈抑制和和阻遏；AKIII受赖氨酸的反反馈抑制和阻阻遏。（二）别构构酶又称变构酶。。有些酶的分子子表面除了活活性中心外，，还具有重要要的功能部位位——调节中心调节中心可以与小分子子的代谢物相相结合，使酶酶分子的构象象发生改变，，从而影响酶酶的活性。这这种作用叫变构效应(又叫别构效应应)；具有变构效应的酶叫变构酶，引起变构的的小分子物质质叫变构剂(调节物)。（二）别构构酶变构酶（别构构酶）是指一一些含有2个或2个以上亚基的的寡聚酶，在在变构酶分子子上，别构效效应剂的调节节部位一般远远离活性中心心，但活性部部位与调节部部位之间或者者活性部位之之间，存在着着相互作用（（变构效应，，协同效应））。调节物与与酶分子的调调节部位结合合之后，引起起酶分子构象象发生变化，，从而提高或或降低活性部部位的酶活性性使酶活性升高高的变构叫正正变构，此时时的变构剂叫叫正变构剂(正调节物)；使酶活性降低低的变构叫负负变构，此时时的变构剂叫叫负变构剂(负调节物)。（二）别构构酶变构酶的特点点：变构酶分子上除了活性中心外，还有调节中心。这两个中心处在酶蛋白的不同部位，有的在不同的亚基上，有的在同一亚基上。变构酶的v-[S]的关系不符合米氏方程，所以其曲线不是双曲线型。已知的变构酶都是寡聚酶。别构酶动力学学曲线A.为非调节酶的的曲线B.为别构酶的S形曲线别构酶的调节节作用：不同的别构酶的调节物分子不同。有的别构酶具有同促效应，有的别构酶具有异促效应，更多的别构酶酶是既具有同促效应又具有异促效应。别构酶的活性中心负责酶对底物的结合与催化别构中心则负责调节酶反应的速度。（三）多功功能酶多功能酶一般般指结构上只只有一条多肽肽链，但具有有两种或两种种以上的催化化活力或结合合功能的蛋白白质。现已有证据证证明，多功能能酶是由于部部分或完全的的基因融合而而形成的。对上述同工酶酶、别构酶和和多功能酶的的探讨，将有有助于阐明代代谢过程的调调节机制，以以便更好的加加以控制，使使代谢产物得得以提高，意意义是十分重重大的。第二节微微生物代谢的的协调作用微生物有着精精确的代谢调调节系统，以以保证上千种种酶能正确无无误地进行催催化反应。微生物的代谢谢调节方式很很多，其中以以调节代谢流流的方式最为为重要，它包包括调节酶的的合成量（“粗调”）和调节现成成酶分子的催催化活力（“细调”），两者往往往密切配合和和协调，以达达到最佳调节节效果通过自然缺损损或人工突变变获得微生物物代谢调控的的变异菌株，，提供发酵工工业用高产菌菌株一、酶活性的的调节酶活性的调节节是指在酶分分子水平上的的一种代谢调调节，它是通通过改变现成成的酶分子活活性来调节新新陈代谢的速速率，包括酶酶活性的激活活和抑制。酶活性的激活活系指在分解代代谢途径中，，后面的反应应可被较前面面的中间产物物所促进。酶活性的抑制制主要是反馈抑抑制，它主要要表现在某代代谢途径的末末端产物（即即终产物）过过量时，这个个产物可反过过来直接抑制制该途径中第第一个酶的活活性，促使整整个反应过程程减慢或停止止，避免终产产物的过多累累积。1.酶活性的激活活在激活剂的作作用下，使原原来无活性的的酶变成有活活性，或使原原来活性低的的酶提高了活活性的现象。。代谢调节的激激活作用主要要是指代谢物物对酶的激活活。前体激活是指指代谢途径中中后面的酶促促反应，可被被该途径中较较前面的一个个中间产物所所促进。代谢中间产物物的反馈激活活是指代谢中中间产物对该该代谢途径的的前面的酶起起激活作用2.酶活性的抑制制抑制和激活相相反。由于某某些物质的存存在，降低酶酶活性，称为为抑制。抑制制可以是不可可逆的，这将将造成代谢作作用的停止；；抑制也有可可逆的，当抑抑制剂除去后后，酶活性又又恢复。在代代谢调节过程程中所发生的的抑制现象主主要是可逆的的，而且大多多属于反馈抑抑制。反馈抑制制是指代代谢的末末端产物物对酶(往往是代代谢途径径中的第第一个酶酶)活性的抑抑制。。反馈抑抑制作用用在生物物体内普普通存在在，它在在维持细细胞正常常代谢、、经济有有效地利利用代谢谢原料、、以及适适应环境境的变化化，都具具有重要要作用。。包括无无分支代代谢途径径的调节节和有分分支代谢谢途径的的调节。。2.1无分支代代谢途径径的调节节无分支代代谢途径径的调节节通常是是在线形形的代谢谢途径中中末端产产物对催催化第一一步反应应的酶活活性有抑抑制作用用。例如，在在大肠杆杆菌中，，由苏氨氨酸(Thr)合成异亮亮氨酸(IIeu)时，异亮亮氨酸对对催化反反应途径径中的第第一步反反应的苏苏氨酸脱脱氨酶(TD)有抑制作作用。2.2有分支代代谢途径径的调节节在有两种种或两种种以上的的末端产产物的分分支合成成代谢途途径中，，调节方方式较复复杂，其其共同特特点是每每个分支支途径的的末端产产物控制制分支点点后的第第一个酶酶，同时时每个末末端产物物又对整整个途径径的第一一个酶有有部分的的抑制作作用，分分支代谢谢的反馈馈调节方方式有多多种：（1）同工酶酶调节；；（2）协同反反馈抑制制；（3）合作反反馈抑制制；（4）累积反反馈抑制制；（5）顺序反反馈抑制制（2）协同反馈馈抑制指分支代代谢途径径中的几几个末端端产物同同时过量量时才能能抑制共共同途径径中的第第一个酶酶的一种种反馈调调节方式式。例如，荚荚膜红假假单胞菌菌中天门门冬氨酸酸族氨基基酸生物物合成途途径中，，天门冬冬氨酸激激酶(AK)是受末端端产物赖赖氨酸和和苏氨酸酸的协同同反馈抑抑制。（3）合作反馈馈抑制指两种末末端产物物同时存存在时，，可以起起着比一一种末端端产物大大得多的的反馈抑抑制作用用。例如，一一定量的的GMP或AMP仅能抑制制5-磷酸核糖糖-1-焦磷酸酰酰胺基转转移酶活活力的10％，而当当二者混混合时，，则可抑抑制其酶酶活力的的50％。因为为这些嘌嘌呤核苷苷酸与5-磷酸核糖糖-1-焦磷酸并并无结构构相似性性，又因因该酶是是一种调调节酶，，GMP和AMP可能分别别结合在在该酶的的不同部部位上。例如，在在嘌呤核核苷酸的的生物合合成途径径中，催催化第一一步反应应的酶，，5-磷酸核糖糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基基转移酶酶，可被被各种嘌嘌呤核苷苷酸产物物(如AMP、GMP)所抑制。。（4）累积积反馈抑抑制在分支代代谢途径径中各种种末端产产物单独独过量时时，它们们各自能能对途径径中的第第一个反反应的酶酶仅产生生较小的的抑制作作用。一一种末端端产物单单独过量量并不影影响其它它末端产产物的形形成，只只有当几几种末端端产物同同时过量量时，才才对途径径中的第第一个酶酶产生较较大的抑抑制。例如，大大肠杆菌菌谷氨酰酰胺合成成酶(GS)活性的调调节是一一个典型型的累积积反馈调调节的例例子。谷氨酰胺胺由谷氨氨酸、铵铵和ATP合成。谷谷氨酰胺胺中的酰酰胺基是是色氨酸酸、组氨氨酸、氨氨基甲酰酰磷酸、、6-磷酸葡萄萄糖胺、、CTP、AMP、GMP等化合物物生物合合成过程程中的氮氮源。谷谷氨酰胺胺合成酶酶被谷氨氨酰胺代代谢的每每种末端端产物以以及丙氨氨酸和甘甘氨酸所所累积抑抑制。谷谷氨酰胺胺合成酶酶对这些些抑制物物中的每每一种末末端产物物均有特特异的结结合部位位。当上上述8种末端产产物同时时过量都都与酶结结合时，，谷氨酰酰胺合成成酶的活活性将受受到最大大的抑制制。（5）顺序反反馈抑制制分支代谢谢途径中中的两个个末端产产物，不不能直接接抑制途途径中的的第一个个酶，只只有当两两个末端端产物都都过量时时，才能能对途径径中的第第一个酶酶有抑制制作用。例如，枯枯草杆菌菌在芳香香族氨基基酸合成成中，色色氨酸(Try)抑制邻氨氨基苯甲甲酸合成成酶(AS)，苯丙氨氨酸(Phe)抑制预苯苯酸脱水水酶(PT)，酪氨酸酸(Tyr)抑制预苯苯酸脱氢氢酶(PD)，预苯酸酸和分支支酸又部部分地抑抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖糖酸合成成酶(DS)。EP：磷酸烯烯醇丙酮酮酸；E4P：4-磷酸赤藓藓糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖糖酸；CA：分支酸酸；Per：预苯酸酸；AA：邻氨基基苯甲酸酸；HPPA：对羟基基苯丙酮酮酸；PPA：苯丙酮酮酸；Tyr：酪氨酸酸；Try：色氨酸酸；Phe：苯丙氨氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖糖酸合成成酶；II：邻氨基基苯甲酸酸合成酶酶；III：分支酸酸变位酶酶；IV：预苯酸酸脱氢酶酶；V：预苯酸酸脱水酶酶二、酶合合成的调调节酶合成的的调节是是一种通通过调节节酶的合合成量进进而调节节代谢速速率的的调节机机制，这这是一种种在基因因水平上上的代谢谢调节。。凡能促进进酶生物物合成的的现象，，称为诱导能阻碍酶酶生物合合成的现现象，则则称为阻遏。举例：亮亮白曲霉霉原来不不能合成成蔗糖酶酶，所以以不能利利用蔗糖糖，但如如果在培培养基内内加入蔗蔗糖，一一段时间间后，可可合成蔗蔗糖酶，，并利用用蔗糖。。两种调节节的对比比酶合成的调节酶活性的调节不同点调节对象通过酶量的变化控制代谢速率控制酶活性，不涉及酶量变化调节效果相对缓慢快速、精细调节机制基因水平调节，调节控制酶合成代谢调节，它调节酶活性相同点细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。1.诱导根据酶合合成与底底物的关关系将酶酶分为组成型与诱导型两类。组成酶是细细胞固有的的酶，其合合成受相应应基因控制制，与底物物、底物结结构类似物物及环境条条件无关，，它主要用用于调节初初级代谢。。诱导酶是细细胞为适应应外来底物物或底物结结构类似物物而临时合合成的酶。。如E.coli在含乳糖培培养基上产产生的β-半乳糖苷酶酶和半乳糖糖苷渗透酶酶就是由乳乳糖存在而而诱导产生生的。能促促进诱导酶酶产生的物物质称为诱诱导物。底底物、难以以代谢的底底物结构类类似物及底底物前体均均可作为诱诱导物。酶合成诱导导的机制在没有诱导导物存在时时，调节基基因R编码的阻遏遏蛋白与操操纵基因O相结合，使使附着于启启动基因P上的RNA聚合酶不能能通过，从从而阻止了了RNA聚合酶对结结构基因S的转录；当当诱导物存存在时，阻阻遏蛋白因因受诱导物物作用而构构型发生变变化，失去去与操纵基基因的结合合能力，从从操纵基因因上解脱下下来，使RNA聚合酶能对对结构基因因进行转录录，进而翻翻译成酶蛋蛋白。2.阻遏在微生物的的代谢过程程中，当某某途径的末末端产物过过量时，可可通过阻碍碍该代谢途途径中包括括关键酶在在内的一系系列酶的生生物合成，，彻底控制制代谢和末末端产物合合成。阻遏遏作用有利利于微生物物从合成源源头节省有有限的养料料与能量。。阻遏可分为为末端产物阻阻遏和分解代谢物物阻遏。酶合成的阻阻遏的机制制终产物的反反馈阻遏在在转录水平平上进行，，终产物为为辅阻遏物物，它可激激活由调节节基因R生成的无活活性阻遏蛋蛋白。辅阻阻遏物与阻阻遏蛋白结结合形成活活化阻遏物物，它能与与操纵基因因O结合，阻止止RNA聚合酶对结结构基因S的转录。2.1末端产物阻阻遏指由某代谢谢途径末端端产物的过过量累积而而引起的阻阻遏。对直直线式反应应途径来说说，末端产产物阻遏的的情况较为为简单，即即产物作用用于代谢途途径中的各各种酶，使使之合成受受阻遏。2.2分解代谢物物阻遏指细胞内同同时有两种种分解底物物（碳源或或氮源）存存在时，利利用快的那那种分解底底物会阻遏遏利用慢的的底物的有有关酶合成成的现象。。分解过程中中所产生的的中间代谢谢物引起的的阻遏作用用。某些中间代代谢物或末末端代谢物物的过量累累积而阻遏遏代谢途径径中一些的的酶合成。。如，葡萄糖糖效应。三、能荷调调节能荷：即指指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为为代谢反应应供能的高高能磷酸键键的量度。。能荷的大小小与细胞中中ATP、ADP和AMP的相对含量量有关。当当细胞中全全部腺苷酸酸均以ATP形式存在时时，则能荷荷最大，为为100%，即能荷为为满载。当当全部以AMP形式存在时时，则能荷荷最小，为为零。当全全部以ADP形式存在时时，能荷居居中，为50%。若三者并并存时，能能荷则随三三者含量的的比例不同同而表现不不同的百分分值。三、能荷调调节巴斯德效应应：氧气的存在在可以使酵酵母细胞进进行呼吸作作用而乙醇醇的产量显显著下降。。机理：(1)氧气增加，，ATP含量增加。。大量的TCA代谢产物抑抑制PFK（2）无机磷和和ADP激活PFK和HK,有氧时降低低无机磷和和ADP（3）G-6-P积累使HK抑制第三节代代谢调控控在工业发发酵中的应应用正常情况下下，微生物物代谢产物物由于反馈馈抑制和反反馈阻遏是是不会大量量积累的。。但自然界界里常发现现一些微生生物产生了了过量的代代谢产物，，这主要是是由于这些些微生物代代谢机制失失调造成的的，在工业业发酵上，，可运用遗遗传的和环环境的控制制和人为的的代谢调节节，使其产产物大量积积累。如氨基酸发发酵生产就就是在代谢谢调节研究究的基础上上发展起来来的。目前前已经能够够在转录和和翻译上控控制微生物物的代谢，，使微生物物工业发酵酵进入了一一个崭新阶阶段，即代代谢控制发发酵阶段。。所谓的代代谢控制发发酵，就是是人为地在在DNA分子水平上上改变和控控制微生物物的代谢活活动，使目目的产物大大量生成、、积累。一般改变微微生物代谢谢调节的方方法有如下下几种:第一种是是采用物理理化学诱变变，获得营营养缺陷型型第二种方法法是应用抗抗反馈调节节突变法。。第三种就是是控制发酵酵条件，改改变细胞的的渗透性。。一、应用营营养缺陷型型菌株以解解除正常的的反馈调节节这是氨基酸酸生产菌育育种的最有有效的办法法。营养缺缺陷型是指指某菌种失失去合成某某种物质的的能力，即即合成途径径中某一步步发生突变变，使合成成反应不能能完成，最最终产物不不能积累到到引起反馈馈调节的浓浓度，从而而有利于中中间产物的的积累。例例如，用高高丝氨酸缺缺陷型生产产菌进行赖赖氨酸发酵酵。一般在在形成赖氨氨酸的过程程中有3种产物生成成，只有赖赖氨酸和苏苏氨酸都达达到一定浓浓度时，才才能形成反反馈抑制，，从高丝氨氨酸切断这这两个分支支后，不能能形成苏氨氨酸，也就就不能形成成反馈抑制制。最后使使赖氨酸的的大量积累累，这是打打破代谢调调节的第一一种方法。。天冬氨酸黄色色短短杆杆菌菌的的代代谢谢过过程程甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ抑制制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶天冬氨酸人工工控控制制黄黄色色短短杆杆菌菌的的代代谢谢过过程程生生产产赖赖氨氨酸酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ甲硫氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝丝氨氨酸酸脱氢氢酶酶不能能合合成成可以以大大量量积积累累赖氨酸人工工诱诱变变的的菌种种不不能能产产生生二、、应应用用抗抗反馈馈