分子荧光分析法课件

第五章分子荧光分析法第一节基本原理第二节仪器第三节定性定量分析第四节荧光新技术和应用实例第五章分子荧光分析法第一节基本原理1第一节基本原理一、分子荧光的发生过程分子的激发态荧光的产生激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱的关系二、分子结构与荧光关系荧光效率分子结构与荧光的关系影响荧光强度的外界因素荧光强度与荧光物质浓度的关系第一节基本原理一、分子荧光的发生过程2第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法(MolecularFluorescencespectrophotometry)

概述1.荧光：当分子吸收一定能量后，跃迁至激发态。由第一电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能级，以光的形式放出能量，产生荧光。2.荧光分析法：通过测定所发射荧光的特性和强度，对物质定性、定量分析的方法。3.荧光分析法的优点：灵敏度高，最低检测浓度可达

10-7～10-9g/ml，选择性好，需样量少，方法简便。第五章分子荧光分析法第五章分子荧光分析法3第五章分子荧光分析法

第一节基本原理一、分子荧光的发生过程1.分子的激发态

（1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分子去活化过程。（2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方向相反，称激发单线态。（3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为平行时是激发三线态。第五章分子荧光分析法第一节基本原理42．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能级，这种光称为荧光。3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础（1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐标作图E荧-λ激（2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐标作图E荧-λ荧第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法54．激发光谱和荧光光谱的关系：（1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改变。因此荧光光谱只有一个谱带。（2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法6二、分子结构与荧光关系1.荧光效率

能发射荧光物质条件：①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。②分子必须有较高的荧光效率。③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数第五章分子荧光分析法

二、分子结构与荧光关系第五章分子荧光分析法72.分子结构与荧光的关系（1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键脂肪烃π-π激（2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增大。（3）取代基效应：

①给电子基：荧光效率提高。

②吸电子基：荧光减弱熄灭。③对π电子共轭体系作用小，对F无影响。第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法83.影响荧光强度的外界因素（1）温度：温度升高，碰撞增多，荧光效率降低。（2）溶剂：不同溶剂中荧光光谱和荧光强度会有显著变化。溶剂极性增加，荧光强度增大。杂质可使荧光增强或减少。（3）pH值：荧光物质为弱酸或弱碱，不同pH值，平衡改变，使分子型体和离子型体的浓度及比例不同，荧光强度有差异。（4）散射光：因碰撞使运动方向改变而向不同角度散射的光为散射光。瑞利散射光只方向改变而波长不变的散射光。莱曼散射光是方向和量都改变的散射光。第五章分子荧光分析法

3.影响荧光强度的外界因素第五章分子荧光分析法9（5）荧光熄灭的影响荧光熄灭：荧光物质，溶剂，溶质分子间相互作用使荧光强度降低或与浓度不呈线性关系的现象为荧光熄灭。1）荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。2）荧光熄灭产生原因：①荧光物质与熄灭剂碰撞，能量损失。②两者作用生成不发光的配合物。③向荧光物质中加入溴或碘后易发生无辐射去活化过程。④荧光物质超过1g/L时，发生自吸收或聚合。⑤有溶解氧存在已发生氧化或促进无辐射去活化过程。第五章分子荧光分析法

（5）荧光熄灭的影响第五章分子荧光分析法104．荧光强度与荧光物质浓度的关系（1）荧光方向：荧光可在各方向观察到，因激发光可部分透过溶液，为减小干扰，在与透射垂直方向观测。（2）选两个不同波长光：λ激、λ荧（3）定量关系：

F=K’C(abc≤0.05)定量分析基础第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法11第二节仪器一、仪器的主要部件构造：激发光源——单色器——样品池——单色器——检测器等四部分1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光源。

主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯2.分光系统：第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽间，滤去非选择波长的激发光。第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧光。第五章分子荧光分析法

第二节仪器第五章分子荧光分析法123.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm以下紫外光。4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。光二极管阵列检测器。二、仪器的类型1.光电荧光计：滤光片荧光计。溴钨灯，滤光片，光电管。2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，光电倍增管。第五章分子荧光分析法

3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm第五章分13第三节定性定量分析一、定性分析由两个特征光谱（荧光光谱，激发光谱）定性，可靠性强。但一定有标准品作对照。二、定量分析方法

1、标准曲线法：

2、直接比较法，空白荧光为F0时，

Cs/Cx=(Fs-F0)/(Fx-F0)第五章分子荧光分析法

第三节定性定量分析第五章分子荧光分析法14第四节光新技术和应用实例一、新技术1.激光荧光分析：用波长更长，强度更大的激光作光源，提高荧光法的灵敏度和专一性。可协调激光器作光源，荧光单色器省略。2.同步荧光分析：激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值。3.时间分辨荧光分析：二、应用1、无机物的荧光分析：8羟基喹啉及其衍生物，黄酮类试剂，二氨基化合物2、有机物的荧光分析：油脂苯并芘测定，尿中N-甲基尼克酰胺。3、核酸分子荧光探针第五章分子荧光分析法

第四节光新技术和应用实例第五章分子荧光分析法15第五章分子荧光分析法第一节基本原理第二节仪器第三节定性定量分析第四节荧光新技术和应用实例第五章分子荧光分析法第一节基本原理16第一节基本原理一、分子荧光的发生过程分子的激发态荧光的产生激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱的关系二、分子结构与荧光关系荧光效率分子结构与荧光的关系影响荧光强度的外界因素荧光强度与荧光物质浓度的关系第一节基本原理一、分子荧光的发生过程17第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法(MolecularFluorescencespectrophotometry)

概述1.荧光：当分子吸收一定能量后，跃迁至激发态。由第一电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能级，以光的形式放出能量，产生荧光。2.荧光分析法：通过测定所发射荧光的特性和强度，对物质定性、定量分析的方法。3.荧光分析法的优点：灵敏度高，最低检测浓度可达

10-7～10-9g/ml，选择性好，需样量少，方法简便。第五章分子荧光分析法第五章分子荧光分析法18第五章分子荧光分析法

第一节基本原理一、分子荧光的发生过程1.分子的激发态

（1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分子去活化过程。（2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方向相反，称激发单线态。（3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为平行时是激发三线态。第五章分子荧光分析法第一节基本原理192．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能级，这种光称为荧光。3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础（1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐标作图E荧-λ激（2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐标作图E荧-λ荧第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法204．激发光谱和荧光光谱的关系：（1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改变。因此荧光光谱只有一个谱带。（2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法21二、分子结构与荧光关系1.荧光效率

能发射荧光物质条件：①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。②分子必须有较高的荧光效率。③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数第五章分子荧光分析法

二、分子结构与荧光关系第五章分子荧光分析法222.分子结构与荧光的关系（1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键脂肪烃π-π激（2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增大。（3）取代基效应：

①给电子基：荧光效率提高。

②吸电子基：荧光减弱熄灭。③对π电子共轭体系作用小，对F无影响。第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法233.影响荧光强度的外界因素（1）温度：温度升高，碰撞增多，荧光效率降低。（2）溶剂：不同溶剂中荧光光谱和荧光强度会有显著变化。溶剂极性增加，荧光强度增大。杂质可使荧光增强或减少。（3）pH值：荧光物质为弱酸或弱碱，不同pH值，平衡改变，使分子型体和离子型体的浓度及比例不同，荧光强度有差异。（4）散射光：因碰撞使运动方向改变而向不同角度散射的光为散射光。瑞利散射光只方向改变而波长不变的散射光。莱曼散射光是方向和量都改变的散射光。第五章分子荧光分析法

3.影响荧光强度的外界因素第五章分子荧光分析法24（5）荧光熄灭的影响荧光熄灭：荧光物质，溶剂，溶质分子间相互作用使荧光强度降低或与浓度不呈线性关系的现象为荧光熄灭。1）荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。2）荧光熄灭产生原因：①荧光物质与熄灭剂碰撞，能量损失。②两者作用生成不发光的配合物。③向荧光物质中加入溴或碘后易发生无辐射去活化过程。④荧光物质超过1g/L时，发生自吸收或聚合。⑤有溶解氧存在已发生氧化或促进无辐射去活化过程。第五章分子荧光分析法

（5）荧光熄灭的影响第五章分子荧光分析法254．荧光强度与荧光物质浓度的关系（1）荧光方向：荧光可在各方向观察到，因激发光可部分透过溶液，为减小干扰，在与透射垂直方向观测。（2）选两个不同波长光：λ激、λ荧（3）定量关系：

F=K’C(abc≤0.05)定量分析基础第五章分子荧光分析法

第五章分子荧光分析法26第二节仪器一、仪器的主要部件构造：激发光源——单色器——样品池——单色器——检测器等四部分1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光源。

主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯2.分光系统：第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽间，滤去非选择波长的激发光。第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧光。第五章分子荧光分析法

第二节仪器第五章分子荧光分析法273.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm以下紫外光。4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。光二极管阵列检测器。二、仪器的类型1.光电荧光计：滤光片荧光计。溴钨