第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件

第十四章大肠杆菌基因工程第十四章大肠杆菌基因工程1第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征全基因组测序，遗传背景清楚，共有4405个开放阅读框架。基因克隆表达系统成熟完善。大肠杆菌表达外源基因的优势第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征全基因组测序，遗传背景清楚2繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。成本低繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。3缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白。不具备真核生物的蛋白质复性系统。其细胞膜间隙含有大量的内毒素，可能混在产物里。大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。大肠杆菌表达外源基因的劣势4第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理启动子5启动子大肠杆菌启动子的强弱取决于启动子本身的序列，尤其是-10区和-35区的碱基组成及彼此间的距离启动子与外源基因转录起始位点之间的距离启动子大肠杆菌启动子的强弱取决于启动子本身的序列，尤其是-16启动子最佳作用距离的探测其中目的基因表达量最高的克隆即具有最佳的启动子作用距离。若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。启动子最佳作用距离的探测其中目的基因表达量最高的克隆即具有最7第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件8启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上，受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒报告基因galK的表达产物联合作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解成红色素物质。鸟枪法克隆启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动9转化galE+、galT+的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆转化galE+、galT+的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活10依据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。将大肠杆菌基因组文库中的重组质粒与RNA聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性内切酶对其进行消化，未与RNA聚合酶保温的同一重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位于RNA聚合酶保护区域内，即该区域存在启动子结构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。酶保护法分离依据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。将大肠杆11原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说，这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性（即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。滤膜结合法分离原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白12常用的大肠杆菌的启动子Plac来源于乳糖操纵子Ptrp来源于色氨酸操纵子PL来源于λ噬菌体早期操纵子PrecA来源于recA基因常用的大肠杆菌的启动子Plac来源于乳糖操纵子13启动子的构建为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表达要求。启动子的构建为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛14为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表达要求。由Ptrp-35区序列和Plac-10区序列重组而成的杂合启动子Ptac，其相对强弱分别是Ptrp的三倍和Plac的11倍。

为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还15启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅增加。启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性野生型的Plac与其16第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件17野生型的Plac上游附近具有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少。因此基因工程上使用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5野生型的Plac上游附近具有代谢激活因子（CAP）结合区，c18第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件19而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加入葡萄糖，因此在实际操作中通常使用的是野生型Plac启动子的突变体PlacUV5启动子。它含有一个突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与PlacUV5相同。而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加入葡萄糖，因此在20色氨酸启动子Ptrp的可控性Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态，在培养系统中去除色氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因的表达。色氨酸启动子Ptrp的可控性Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物21第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件22λ噬菌体启动子PλL的可控性PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PλL，cI857阻遏蛋白在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达，但在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。λ噬菌体启动子PλL的可控性PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱23当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温度进行诱导表达。当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI阻遏蛋白合成24第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件25终止子外源基因在强启动子的控制下表达，易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。终止子外源基因在强启动子的控制下表达，易发生转录过头现象，即26过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需时间相应增加，外源基因本身的转录效率下降；过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，原因如下：27如外源基因下游紧接有载体上其它重要基因或DNA功能区域，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；如外源基因下游紧接有载体上其它重要基因或DNA功能区域，则R28过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌的能量消耗。过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌的能量消耗29过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，大大降低外源基因编码产物的翻译效率。过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，大大降低外源基因编码30强终止子的选择与使用目前常用的终止子来自于大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的TΦ，对于一些终止作用较弱的终止子，通常采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。强终止子的选择与使用目前常用的终止子来自于大肠杆菌rRNA操31终止子也可像启动子一样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。终止子也可像启动子一样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因32终止子探针质粒pCP1可在Apr的转化子中筛选对四环素敏感的重组克隆。终止子探针质粒pCP1可在Apr的转化子中筛选对四环素敏感的33核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌中的高效表达取决于：转录启动频率mRNA的翻译起始效率：由其5’端核糖体结合位点（RBS）的序列决定核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌中的高效表达取决于：转录启动34RBS序列的特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6~8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’（SD序列）---16SrRNA翻译起始密码子RBS序列的特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6~8个核35SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成36第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件37SD序列的影响：取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中GGAG四个碱基序列尤为重要，其中任一换成C或T均会导致翻译效率大幅度降低。mRNASmallribosomalsubunitSD序列的影响：取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性38SD序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列下游若是AAAA或UUUU翻译效率最高。CCCC或GGGG的翻译效率分别是最高值的50%和25%。SD序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列下游若是AAA39紧邻AUG的前三个碱基成分对翻译效率也很重要。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA：最佳碱基为UAU或CUU，若用UUC、UCA或AGG取代，则酶的表达水平降为1/20。紧邻AUG的前三个碱基成分对翻译效率也很重要。如大肠杆菌β-40SD序列与起始密码子之间距离的影响：精确距离保证了mRNA在核糖体定位后，翻译起始密码子正好处于核糖体复合物结构中的P位。多数情况下，它们之间为7个碱基。SD序列与起始密码子之间距离的影响：精确距离保证了mRNA在41起始密码子及其后续密码子的影响：三个起始密码子：AUG、GUG、UUG识别频率：GUG=50%AUGUUG=25%AUG起始密码子及其后续密码子的影响：三个起始密码子：AUG、GU42从起始密码子开始的前几个密码子碱基要保证不与mRNA的5’端非编码区形成颈环结构，从而严重干扰mRNA在核糖体的准确定位。从起始密码子开始的前几个密码子碱基要保证不与mRNA的5’端43密码子生物体对密码子的偏爱性：不同生物甚至是同种生物不同的蛋白编码基因，对于同一氨基酸所对应的简并密码子，使用频率不同，即生物体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。密码子生物体对密码子的偏爱性：不同生物甚至是同种生物不同的蛋44密码子的简并特性决定了来自不同生物因而碱基组成也不同的基因组中，简并密码子出现的非随机性。在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体ΦX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高，而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。密码子的简并特性决定了来自不同生物因而碱基组成也不同的基因组45第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件46密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能47在碱基含量没有显著差异的生物基因组中，简单密码子的使用频率可能是由密码子与反密码子的作用强度所决定的。适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行；弱配对作用可能使氨酰基tRNA分子进入核糖体A位需要总费更多的时间；而强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。在碱基含量没有显著差异的生物基因组中，简单密码子的使用频率可48tRNA上反密码子的第一位碱基如果是修饰的U，则它与A配对的机会多于C；如果是I，则与U和C配对的频率高于A。反密码子第1位碱基密码子第3位碱基AUCGGU，CUA，CIU，C，ＡtRNA上反密码子的第一位碱基如果是修饰的U，则它与A配对的49细胞内tRNA的含量简并密码子的使用频率与相应tRNA的丰度呈正相关，通常，表达量较大的基因含有较少种类的密码子，而且这些密码子又对应于含量高的tRNA分子，这样细胞便能以更快的速度合成需求量大的蛋白质；而对于需求量少的蛋白质而言，其基因中含有较多与低丰度tRNA相对应的密码子，用以控制该蛋白质的合成速度。细胞内tRNA的含量简并密码子的使用频率与相应tRNA的丰度50密码子偏爱性对外源基因表达的影响原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，两种策略可以使外源基因的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：密码子偏爱性对外源基因表达的影响原核生物和真核生物基因组中密51外源基因全基因合成同步表达相关tRNA编码基因外源基因全基因合成52质粒拷贝数目前广泛使用的表达型载体在每个大肠杆菌细胞中可达到数百甚至数千个拷贝，质粒分子的过多增殖会影响受体细胞的生长与代谢，进而导致质粒的不稳定性以及外源基因宏观表达水平的下降。质粒拷贝数目前广泛使用的表达型载体在每个大肠杆菌细胞中可达到53解决此难题的有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制轨道，即在细菌生长周期的最适阶段将重组质粒扩增到一个最佳程度。解决此难题的有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制轨道，即在细54质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60，42℃时拷贝数迅速增至300~600，同时受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达。质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，2855第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件56第三节、大肠杆菌工程菌的构建策略大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的拆叠复性和翻译后加工系统;导致异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中不稳定性的主要原因是：第三节、大肠杆菌工程菌的构建策略大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白57大肠杆菌不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构以及众多基因表达产物的稳定因子;高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，致使蛋白分子间的相互作用增强。大肠杆菌不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构以及众多基因表达产58包涵体型异源蛋白的表达包涵体（InclusionBodies）及其性质：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体型异源蛋白的表达包涵体（InclusionBodie59以包涵体形式表达蛋白的优点：能简化外源基因表达产物的分离纯化程序：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片结合蛋白，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细胞裂解物中分离出来。以包涵体形式表达蛋白的优点：能简化外源基因表达产物的分离纯化60能在一定程度上保持表达产物的结构稳定：形成包涵体后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已不构成威胁。能在一定程度上保持表达产物的结构稳定：形成包涵体后，大肠杆菌61以包涵体形式表达蛋白的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间结构的目的蛋白。以包涵体形式表达蛋白的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了62以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中的蛋白量占细胞总蛋白量的20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键是选择高表达的载体，事实上，这种高表达效率也是包涵体的长处所在。以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如未进行特殊设计（如分泌型表63包涵体变性复性操作：在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质，包涵体的蛋白质属于这两种状态，需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。包涵体变性复性操作：在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质64N：天然状态U：变性状态C：共价修饰A：集聚状态I：有效变性复性过程中的中间状态X：脱离有效变性复性过程而进入集聚的中间状态N：天然状态65温度表达水平细菌遗传性状异源蛋白氨基酸序列形成包涵体的影响因素温度形成包涵体的影响因素66分泌型异源蛋白的表达大肠杆菌中异源蛋白的定位以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中。分泌型异源蛋白的表达大肠杆菌中异源蛋白的定位以可溶性或不溶性67通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋白产物N端的信号肽序列是蛋白质分泌的前体条件。通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋68以分泌形式表达蛋白的优点：目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是细胞质中的10倍。蛋白易于分离以分泌形式表达蛋白的优点：目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛素原69外源重组蛋白N端的甲硫氨酸残基可在信号肽的专一性剪切过程中被有效除去。外源重组蛋白N端的甲硫氨酸残基可在信号肽的专一性剪切过程中被70分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌71蛋白质的分泌机制：原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在周质和培养基中的蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，对蛋白酶不敏感。蛋白质的分泌机制：原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋72第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件73分子伴侣的作用机制：识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，并与之结合生成复合物，从而阻止不正确的非折叠途径，促进折叠向正确方向进行。在正确折叠产物中，分子伴侣与之分离，不参与正确折叠产物的功能活动。分子伴侣的作用机制：识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，并74第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件75分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏76因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可77融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与78以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高：尤其对分子量较小的多肽效果更佳。以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高：尤其对分子量79目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和80目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件81目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形82目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋83融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：受体84外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码85两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋86融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）：促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫亲和层析硫氧化还原蛋白（TrxA）：维持良好空间构象外膜蛋白（OmpF）：促进分泌β-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）：维持良好空间构象融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱87目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白88化学断裂法酶促裂解法化学断裂法89化学断裂法：用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。化学断裂法：用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（C90第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件91这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且92酶促裂解法：单残基位点蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。受体蛋白目的蛋白NArgCNC酶促裂解法：单残基位点蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，93几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、94

蛋白内切酶切割位点梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假单孢菌蛋白酶Lys-C猪胰蛋白酶Arg-C/Lys-C

95酶促裂解法：多残基位点为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。酶促裂解法：多残基位点为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带96第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件97第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件98寡聚型异源蛋白的表达从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。寡聚型异源蛋白的表达从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞99另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建100以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达:在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量。以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达:在不提高质粒101稳定表达小分子短肽：短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高。稳定表达小分子短肽：短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中102目的产物回收困难：寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性。目的产物回收困难：寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分103寡聚型目的蛋白表达系统的构建基本战略：寡聚型目的蛋白表达系统的构建基本战略：104第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件105整合型异源蛋白的表达以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳定表达：整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义。整合型异源蛋白的表达以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳106目的基因表达率：低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿。目的基因表达率：低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可107DNA体内重组的基本原理在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。DNA体内重组的基本原理在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广108转位因子依赖型同源序列依赖型细胞内的遗传重组可分为两大类：转位因子依赖型细胞内的遗传重组可分为两大类：109转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子。转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族转位因子是指生物细胞内110噬菌体 G片段（G-Fragment）原核细菌 插入顺序（IS）真核细菌 转座子（Tn、Ty）高等植物可移动因子（Ac、Ds）高等动物 跳跃基因（mobilgene）噬菌体 G片段（G-Fragment）111转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构112转位因子依赖型的体内重组：整合形式转位因子依赖型的体内重组：整合形式113同源序列依赖型的体内重组：基本形式在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离、同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。同源序列依赖型的体内重组：基本形式在很多原核细菌细胞中，染色114同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者115第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件116第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件117蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建无论是在真核生物还是在原核细118在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白119蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lon-）：实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解的，两者分别由lon和clp基因编码，其蛋白水解活性依赖于ATP。lon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。lon-的大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短的细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lo120htpR基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR-）：大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降解也有重要作用，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象，从而提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是lon-htpR-的双缺陷株，非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。htpR基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR-）：大肠杆菌中庞121抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响：大量的实验结果表明，在所有的极性氨基酸中，天门冬氨酸（Asp）的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且Asp残基离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，在多种结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基，都能显著地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定122多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响：大量的实验结果同时表明，如果多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，则蛋白质的稳定性显著改善。多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响：大量的实验结果同时表明123相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶的超敏感区。相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白124第四节、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策工程菌遗传不稳定性的表现形式主要表现在重组质粒的不稳定性：结构不稳定性：重组DNA分子在某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失。第四节、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策工程菌遗传不稳定性的125分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）。分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curin126工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA的降解。工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重127外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序。外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。能量、物质128重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配：逃逸的基本原因。受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排。重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配：逃逸的基本原因。129改善基因工程菌遗传不稳定性的策略根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素，药物和食品生产时禁止使用抗生素。施加选择压力改善基因工程菌遗传不稳定性的策略根据载体上的抗药性标记，向培130根据载体上的营养缺陷型标记，向培养基中添加相应的营养组分。根据载体上的营养缺陷型标记，向培养基中添加相应的营养组分。131使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度。使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数。控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度。控制目的基132培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定。培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定。优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定。优化基因工程133第五节、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素胰岛素的结构及其生物合成第五节、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素胰岛素的结构及其生物合成134人胰岛素的生产方法目前有四种大规模生产人胰岛素的方法直接提取法制胰岛素早期的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。人胰岛素的生产方法目前有四种大规模生产人胰岛素的方法直接提取135化学合成法制胰岛素根据人胰岛素A链、B链的序列，由单个氨基酸从头合成，这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。化学合成法制胰岛素根据人胰岛素A链、B链的序列，由单个氨基酸136化学转型法制人胰岛素猪的胰岛素与人的胰岛素只在B链C末端有一个氨基酸的差异（猪：Ala，人：Thr），因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。化学转型法制人胰岛素猪的胰岛素与人的胰岛素只在B链C末端有一137技术路线：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。技术路线：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该138基因工程法制人胰岛素1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素。称为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。基因工程法制人胰岛素1982年，美国ElyLiLi公司首先139上述基因工程菌合成的重组人胰岛素在临床上与天然人胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示的基因工程在生物医药领域的巨大潜力。上述基因工程菌合成的重组人胰岛素在临床上与天然人胰岛素没有任140A链和B链分别表达法：基因工程菌的构建策略A链和B链分别表达法：基因工程菌的构建策略141表达产物的后处理路线表达产物的后处理路线142生产技术的评价：由于A链和B链上共存6个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率极低，通常只有10%~20%，因此采用这条工艺路线生产的重组胰岛素每克成本高达100美元以上。生产技术的评价：由于A链和B链上共存6个半胱氨酸残基，体外二143人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略144表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：145生产技术的评价：在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比分别表达法更为简捷，而且还需使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使每克最终产品的成本仅50美元。目前美国ElyLiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。生产技术的评价：在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛146A链和B链同时表达法：基因工程菌的构建策略A链和B链同时表达法：基因工程菌的构建策略147分泌型重组胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包涵体形式存在于胞质中。分泌型重组胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰148将胰岛素或胰岛素原编码序列与β-内酰胺酶基因拼接，β-内酰胺酶通常被大肠杆菌分泌的胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。将胰岛素或胰岛素原编码序列与β-内酰胺酶基因拼接，β-内酰胺149第十四章大肠杆菌基因工程第十四章大肠杆菌基因工程150第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征全基因组测序，遗传背景清楚，共有4405个开放阅读框架。基因克隆表达系统成熟完善。大肠杆菌表达外源基因的优势第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征全基因组测序，遗传背景清楚151繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。成本低繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。152缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白。不具备真核生物的蛋白质复性系统。其细胞膜间隙含有大量的内毒素，可能混在产物里。大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。大肠杆菌表达外源基因的劣势153第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理启动子154启动子大肠杆菌启动子的强弱取决于启动子本身的序列，尤其是-10区和-35区的碱基组成及彼此间的距离启动子与外源基因转录起始位点之间的距离启动子大肠杆菌启动子的强弱取决于启动子本身的序列，尤其是-1155启动子最佳作用距离的探测其中目的基因表达量最高的克隆即具有最佳的启动子作用距离。若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。启动子最佳作用距离的探测其中目的基因表达量最高的克隆即具有最156第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件157启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上，受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒报告基因galK的表达产物联合作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解成红色素物质。鸟枪法克隆启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动158转化galE+、galT+的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆转化galE+、galT+的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活159依据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。将大肠杆菌基因组文库中的重组质粒与RNA聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性内切酶对其进行消化，未与RNA聚合酶保温的同一重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位于RNA聚合酶保护区域内，即该区域存在启动子结构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。酶保护法分离依据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。将大肠杆160原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说，这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性（即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。滤膜结合法分离原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白161常用的大肠杆菌的启动子Plac来源于乳糖操纵子Ptrp来源于色氨酸操纵子PL来源于λ噬菌体早期操纵子PrecA来源于recA基因常用的大肠杆菌的启动子Plac来源于乳糖操纵子162启动子的构建为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表达要求。启动子的构建为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛163为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表达要求。由Ptrp-35区序列和Plac-10区序列重组而成的杂合启动子Ptac，其相对强弱分别是Ptrp的三倍和Plac的11倍。

为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还164启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅增加。启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性野生型的Plac与其165第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件166野生型的Plac上游附近具有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少。因此基因工程上使用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5野生型的Plac上游附近具有代谢激活因子（CAP）结合区，c167第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件168而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加入葡萄糖，因此在实际操作中通常使用的是野生型Plac启动子的突变体PlacUV5启动子。它含有一个突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与PlacUV5相同。而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加入葡萄糖，因此在169色氨酸启动子Ptrp的可控性Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态，在培养系统中去除色氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因的表达。色氨酸启动子Ptrp的可控性Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物170第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件171λ噬菌体启动子PλL的可控性PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PλL，cI857阻遏蛋白在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达，但在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。λ噬菌体启动子PλL的可控性PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱172当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温度进行诱导表达。当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI阻遏蛋白合成173第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件174终止子外源基因在强启动子的控制下表达，易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。终止子外源基因在强启动子的控制下表达，易发生转录过头现象，即175过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需时间相应增加，外源基因本身的转录效率下降；过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，原因如下：176如外源基因下游紧接有载体上其它重要基因或DNA功能区域，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；如外源基因下游紧接有载体上其它重要基因或DNA功能区域，则R177过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌的能量消耗。过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌的能量消耗178过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，大大降低外源基因编码产物的翻译效率。过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，大大降低外源基因编码179强终止子的选择与使用目前常用的终止子来自于大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的TΦ，对于一些终止作用较弱的终止子，通常采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。强终止子的选择与使用目前常用的终止子来自于大肠杆菌rRNA操180终止子也可像启动子一样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。终止子也可像启动子一样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因181终止子探针质粒pCP1可在Apr的转化子中筛选对四环素敏感的重组克隆。终止子探针质粒pCP1可在Apr的转化子中筛选对四环素敏感的182核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌中的高效表达取决于：转录启动频率mRNA的翻译起始效率：由其5’端核糖体结合位点（RBS）的序列决定核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌中的高效表达取决于：转录启动183RBS序列的特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6~8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’（SD序列）---16SrRNA翻译起始密码子RBS序列的特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6~8个核184SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成185第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件186SD序列的影响：取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中GGAG四个碱基序列尤为重要，其中任一换成C或T均会导致翻译效率大幅度降低。mRNASmallribosomalsubunitSD序列的影响：取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性187SD序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列下游若是AAAA或UUUU翻译效率最高。CCCC或GGGG的翻译效率分别是最高值的50%和25%。SD序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列下游若是AAA188紧邻AUG的前三个碱基成分对翻译效率也很重要。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA：最佳碱基为UAU或CUU，若用UUC、UCA或AGG取代，则酶的表达水平降为1/20。紧邻AUG的前三个碱基成分对翻译效率也很重要。如大肠杆菌β-189SD序列与起始密码子之间距离的影响：精确距离保证了mRNA在核糖体定位后，翻译起始密码子正好处于核糖体复合物结构中的P位。多数情况下，它们之间为7个碱基。SD序列与起始密码子之间距离的影响：精确距离保证了mRNA在190起始密码子及其后续密码子的影响：三个起始密码子：AUG、GUG、UUG识别频率：GUG=50%AUGUUG=25%AUG起始密码子及其后续密码子的影响：三个起始密码子：AUG、GU191从起始密码子开始的前几个密码子碱基要保证不与mRNA的5’端非编码区形成颈环结构，从而严重干扰mRNA在核糖体的准确定位。从起始密码子开始的前几个密码子碱基要保证不与mRNA的5’端192密码子生物体对密码子的偏爱性：不同生物甚至是同种生物不同的蛋白编码基因，对于同一氨基酸所对应的简并密码子，使用频率不同，即生物体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。密码子生物体对密码子的偏爱性：不同生物甚至是同种生物不同的蛋193密码子的简并特性决定了来自不同生物因而碱基组成也不同的基因组中，简并密码子出现的非随机性。在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体ΦX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高，而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。密码子的简并特性决定了来自不同生物因而碱基组成也不同的基因组194第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件195密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能196在碱基含量没有显著差异的生物基因组中，简单密码子的使用频率可能是由密码子与反密码子的作用强度所决定的。适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行；弱配对作用可能使氨酰基tRNA分子进入核糖体A位需要总费更多的时间；而强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。在碱基含量没有显著差异的生物基因组中，简单密码子的使用频率可197tRNA上反密码子的第一位碱基如果是修饰的U，则它与A配对的机会多于C；如果是I，则与U和C配对的频率高于A。反密码子第1位碱基密码子第3位碱基AUCGGU，CUA，CIU，C，ＡtRNA上反密码子的第一位碱基如果是修饰的U，则它与A配对的198细胞内tRNA的含量简并密码子的使用频率与相应tRNA的丰度呈正相关，通常，表达量较大的基因含有较少种类的密码子，而且这些密码子又对应于含量高的tRNA分子，这样细胞便能以更快的速度合成需求量大的蛋白质；而对于需求量少的蛋白质而言，其基因中含有较多与低丰度tRNA相对应的密码子，用以控制该蛋白质的合成速度。细胞内tRNA的含量简并密码子的使用频率与相应tRNA的丰度199密码子偏爱性对外源基因表达的影响原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，两种策略可以使外源基因的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：密码子偏爱性对外源基因表达的影响原核生物和真核生物基因组中密200外源基因全基因合成同步表达相关tRNA编码基因外源基因全基因合成201质粒拷贝数目前广泛使用的表达型载体在每个大肠杆菌细胞中可达到数百甚至数千个拷贝，质粒分子的过多增殖会影响受体细胞的生长与代谢，进而导致质粒的不稳定性以及外源基因宏观表达水平的下降。质粒拷贝数目前广泛使用的表达型载体在每个大肠杆菌细胞中可达到202解决此难题的有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制轨道，即在细菌生长周期的最适阶段将重组质粒扩增到一个最佳程度。解决此难题的有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制轨道，即在细203质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60，42℃时拷贝数迅速增至300~600，同时受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达。质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，28204第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件205第三节、大肠杆菌工程菌的构建策略大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的拆叠复性和翻译后加工系统;导致异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中不稳定性的主要原因是：第三节、大肠杆菌工程菌的构建策略大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白206大肠杆菌不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构以及众多基因表达产物的稳定因子;高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，致使蛋白分子间的相互作用增强。大肠杆菌不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构以及众多基因表达产207包涵体型异源蛋白的表达包涵体（InclusionBodies）及其性质：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体型异源蛋白的表达包涵体（InclusionBodie208以包涵体形式表达蛋白的优点：能简化外源基因表达产物的分离纯化程序：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片结合蛋白，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细胞裂解物中分离出来。以包涵体形式表达蛋白的优点：能简化外源基因表达产物的分离纯化209能在一定程度上保持表达产物的结构稳定：形成包涵体后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已不构成威胁。能在一定程度上保持表达产物的结构稳定：形成包涵体后，大肠杆菌210以包涵体形式表达蛋白的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间结构的目的蛋白。以包涵体形式表达蛋白的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了211以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中的蛋白量占细胞总蛋白量的20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键是选择高表达的载体，事实上，这种高表达效率也是包涵体的长处所在。以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如未进行特殊设计（如分泌型表212包涵体变性复性操作：在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质，包涵体的蛋白质属于这两种状态，需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。包涵体变性复性操作：在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质213N：天然状态U：变性状态C：共价修饰A：集聚状态I：有效变性复性过程中的中间状态X：脱离有效变性复性过程而进入集聚的中间状态N：天然状态214温度表达水平细菌遗传性状异源蛋白氨基酸序列形成包涵体的影响因素温度形成包涵体的影响因素215分泌型异源蛋白的表达大肠杆菌中异源蛋白的定位以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中。分泌型异源蛋白的表达大肠杆菌中异源蛋白的定位以可溶性或不溶性216通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋白产物N端的信号肽序列是蛋白质分泌的前体条件。通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋217以分泌形式表达蛋白的优点：目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是细胞质中的10倍。蛋白易于分离以分泌形式表达蛋白的优点：目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛素原218外源重组蛋白N端的甲硫氨酸残基可在信号肽的专一性剪切过程中被有效除去。外源重组蛋白N端的甲硫氨酸残基可在信号肽的专一性剪切过程中被219分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌220蛋白质的分泌机制：原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在周质和培养基中的蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，对蛋白酶不敏感。蛋白质的分泌机制：原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋221第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件222分子伴侣的作用机制：识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，并与之结合生成复合物，从而阻止不正确的非折叠途径，促进折叠向正确方向进行。在正确折叠产物中，分子伴侣与之分离，不参与正确折叠产物的功能活动。分子伴侣的作用机制：识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，并223第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件224分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏225因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可226融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与227以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高：尤其对分子量较小的多肽效果更佳。以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高：尤其对分子量228目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和229目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件230目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形231目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋232融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：受体233外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码234两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋235融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）：促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫亲和层析硫氧化还原蛋白（TrxA）：维持良好空间构象外膜蛋白（OmpF）：促进分泌β-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）：维持良好空间构象融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱236目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白237化学断裂法酶促裂解法化学断裂法238化学断裂法：用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降