共轭焦显微镜简介-课件

共轭焦显微镜简介

Confocalmicroscopy

八组王玉兴郭少雄程飞张志强宋百江共轭焦显微镜简介

Confocalmicroscopy

1共轭焦显微镜共焦显微术的形成与发展※共焦显微术的原理※共焦显微镜的分类共焦显微镜的关键技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜的应用共轭焦显微镜共焦显微术的形成与发展2共轭焦显微镜

共轭焦显微技术形成：1953年

美国学者马文·明斯基提出。发展：随后，P.Davidovits,A.f.Slomba和C.J.R.Sheppard等多位学者对共焦成像进行了更细致的研究，越来越多的基于共焦原理的显微术被开发出来。

直到70年代才有真正实用的共焦显微镜问世。

80年代中期才有商品机型出售。

九十年代以来随着计算机图像处理技术的发展，共焦显微术三维层析能力的优点也逐渐凸现出来，受到越来越多研究人员的重视。

近几年对共焦显微术的研究已形成了一个世界性的热潮，人们已经研制出了多种多样的共焦显微镜。

3共焦显微术原理共焦：从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微术原理共焦：从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被4共焦显微术原理共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroicmirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultipliertube，PMT）。共焦显微术原理共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜5激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片6共轭焦显微镜

共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反射式与透射式两种形式。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射后经聚光镜再聚焦到探测器。

7共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反射式与透射式两种形式。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射后经聚光镜再聚焦到探测器。共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反8共焦显微术原理优点：具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的特点，使得它可以对样品的轴向进行光学层析，从而可以重构出样品的三维图像。原因：探测器前面放置了小孔光阑，使得杂散光被大大消除，而且小孔位于聚光镜的焦点处，非物镜焦平面上的光线被挡住，这样探测器的信噪比就大大提高，成像有很高的对比度和清晰度。共焦显微术原理优点：具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的9共轭焦显微镜的分类商业化的共聚焦（共轭焦显）显微镜（Confocalmicroscope）分三类：※共聚焦激光扫描显微镜（ConfocalLaserScanningMicroscope，CLSM，LSCM）（点扫描激光共焦显微镜、线扫描激光共焦显微镜、光纤激光共焦显微镜）转盘共聚焦显微镜（Spinning-disk(Nipkowdisk)confocalmicroscopes）可编程序阵列显微镜（ProgrammableArrayMicroscopes(PAM)）其他：荧光共焦显微镜、共焦干涉显微镜、全息共焦显微镜、非扫描激光共焦显微镜（需做说明）共轭焦显微镜的分类商业化的共聚焦（共轭焦显）显微镜（Conf10显微镜成像清晰度的决定因素:

1.分辨率

2.球差

3.色差显微镜成像清晰度的决定因素:1.分辨率

2.球差

3111、分辨率：

指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。1、分辨率：

指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能12人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率：0.20mm光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm电子显微镜分辨率：0.20nm人眼及各类显微镜的分辨率132、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。2、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上143、色差：

是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。3、色差：

是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色15共焦显微镜的几个关键技术共焦小孔光阑大小的选择：当小孔的直径等于艾利斑大小时既能保证共焦成像的高分辨率和层析能力，又有足够的光能通过小孔被探测器接收。高精度扫描系统的设计：目前主要采用的扫描方式主要有以下几种：（1）机械式工作台扫描2）光束扫描（3）Nipkow盘扫描4）光学扫描光学层析与图像重构算法：由探测器探测到的共焦信号是样品某个层面的反射光，通过改变聚焦深度即可以获得不同断层的光强信息，然后信号经过A/D转换变为数字量，以一定的图像格式存储到计算机中。每个断层的平面图像要经过图像平滑、图像增强等预期处理达到可进行三维重构的要求，再经过三维重构算法将各断层二维图像重构成三维图像。共焦显微镜的几个关键技术共焦小孔光阑大小的选择：当小孔16激光扫描共焦显微镜共聚焦扫描显微镜的系统组成硬件：

激光源共聚焦显微镜步近器检测器光电倍增管计算机图象输出设备（显示器彩色打印机）。软件：

显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统激光扫描共焦显微镜共聚焦扫描显微镜的系统组成17激光共聚焦显微镜构成激光器光电倍增管检测器显微镜步近器计算机电子图像软件激光共聚焦显微镜构成激光器显微镜计算机18激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜19共聚焦显微镜的特点光源共聚焦技术点扫描技术信号放大电子图像软件共聚焦显微镜的特点光源201、光源：激光

用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。

2、采用了共扼聚焦技术

在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。

3、点与面扫描技术

共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。

普通光镜：是在可见光源下一次性成像。

4、图像信号及处理：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。

计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。1、光源：激光

用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激21共扼聚焦原理图共扼聚焦原理图22

普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别

普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别23激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别24激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3.增加侧向分辨率4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响

激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别25激光共聚焦显微镜的优势在结构方面激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高可实现分层扫描可实现连续扫描，可动态记录变化可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像扫描速度快，对样品损伤小激光共聚焦显微镜的优势在结构方面26在应用方面形态观察--高清晰成像半定量--荧光强度分析荧光探针表达量测定定位研究--分层扫描多种荧光标记同时检测荧光标记物绝对定量分析扩展应用---如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等激光共聚焦显微镜的优势在应用方面激光共聚焦显微镜的优势27在效果方面

更灵敏：

共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。

定位更精确：

不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。显微镜扫激光共聚焦显微镜的优势在效果方面

更灵敏：

共聚焦显微镜采用了光电倍增技术28

定量测量：静态的定量测量

对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。动态的定量测量

共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。激光共聚焦显微镜的优势

在效果方面

定量测量：静态的定量测量激光共聚焦显微镜的优势

在效果29快速性：

由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。

数据图像可及时输出或长期储存：

用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。

激光共聚焦显微镜的优势

在效果方面

快速性：

由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短30牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像31牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像32鼠成纤维细胞单克隆anti–β-tubulin标记

高清晰成像鼠成纤维细胞高清晰成像33检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像34培养的293细胞绿色荧光蛋白高清晰成像培养的293细胞绿色荧光蛋白高清晰成像35共聚焦显微镜的应用高清晰成像半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定分层扫描荧光标记物绝对定量分析扩展应用共聚焦显微镜的应用高清晰成像36高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。可以清晰的表现某些细微结构。高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑37半定量荧光强度分析

荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。

荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。

随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。半定量荧光强度分析荧光信号通过光电倍增管转38半定量荧光强度分析随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值半定量荧光强度分析随机圈取细胞39荧光表达量测定利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。荧光表达量测定利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组40荧光表达量测定荧光表达量测定41分层扫描（切片扫描）按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。分层扫描（切片扫描）按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可42分层扫描（切片扫描）当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。入射光被检测层面整个样品白光（不能透过）发射光分层扫描（切片扫描）当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品43分层扫描（切片扫描）较厚层面较薄层面人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。分层扫描（切片扫描）较厚层面44分层扫描（切片扫描）较厚层面（平滑肌损伤可见）较薄层面兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。分层扫描（切片扫描）较厚层面（平滑肌损伤可见）45293细胞GFP的表达293细胞GFP的表达46细胞“CT”片细胞“CT”片47细胞测量细胞测量48荧光强度分析荧光强度分析49空间定位空间定位50三维重建三维重建51植物切片三维重建植物切片三维重建52动态观测激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激下瞬时发生的变化。常用的有检测细胞内游离Ca离子变化、细胞内PH值变化，等等。动态观测激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫53Ca离子动态检测荧光染料：Fluo-3AM。此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，胞外不标记。Ca离子动态检测荧光染料：Fluo-3AM。54Ca离子动态检测加药峰值所选细胞Ca离子动态检测加药峰值所选细胞55Ca离子动态检测胞浆胞核胞浆胞核同时测量Ca离子动态检测胞浆胞核胞浆胞核同时测量56牛肺动脉内皮细胞蓝色：Hoechst33342染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：AlexaFluor488染肌丝蛋白牛肺动脉内皮细胞57藤黄微球菌绿色：活菌红色：死菌染色：LIVE/DEADBacLightBacterialViabilityKit藤黄微球菌58猴胚肾细胞内弓形虫繁殖吖叮橙染色绿色为DNA红色为RNA猴胚肾细胞内弓形虫繁殖59Bravo,LSM!再见，谢谢Bravo,LSM!再见，谢谢60共轭焦显微镜简介

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八组王玉兴郭少雄程飞张志强宋百江共轭焦显微镜简介

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61共轭焦显微镜共焦显微术的形成与发展※共焦显微术的原理※共焦显微镜的分类共焦显微镜的关键技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜的应用共轭焦显微镜共焦显微术的形成与发展62共轭焦显微镜

共轭焦显微技术形成：1953年

美国学者马文·明斯基提出。发展：随后，P.Davidovits,A.f.Slomba和C.J.R.Sheppard等多位学者对共焦成像进行了更细致的研究，越来越多的基于共焦原理的显微术被开发出来。

直到70年代才有真正实用的共焦显微镜问世。

80年代中期才有商品机型出售。

九十年代以来随着计算机图像处理技术的发展，共焦显微术三维层析能力的优点也逐渐凸现出来，受到越来越多研究人员的重视。

近几年对共焦显微术的研究已形成了一个世界性的热潮，人们已经研制出了多种多样的共焦显微镜。

63共焦显微术原理共焦：从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微术原理共焦：从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被64共焦显微术原理共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroicmirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultipliertube，PMT）。共焦显微术原理共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜65激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片66共轭焦显微镜

共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反射式与透射式两种形式。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射后经聚光镜再聚焦到探测器。

67共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反射式与透射式两种形式。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射后经聚光镜再聚焦到探测器。共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反68共焦显微术原理优点：具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的特点，使得它可以对样品的轴向进行光学层析，从而可以重构出样品的三维图像。原因：探测器前面放置了小孔光阑，使得杂散光被大大消除，而且小孔位于聚光镜的焦点处，非物镜焦平面上的光线被挡住，这样探测器的信噪比就大大提高，成像有很高的对比度和清晰度。共焦显微术原理优点：具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的69共轭焦显微镜的分类商业化的共聚焦（共轭焦显）显微镜（Confocalmicroscope）分三类：※共聚焦激光扫描显微镜（ConfocalLaserScanningMicroscope，CLSM，LSCM）（点扫描激光共焦显微镜、线扫描激光共焦显微镜、光纤激光共焦显微镜）转盘共聚焦显微镜（Spinning-disk(Nipkowdisk)confocalmicroscopes）可编程序阵列显微镜（ProgrammableArrayMicroscopes(PAM)）其他：荧光共焦显微镜、共焦干涉显微镜、全息共焦显微镜、非扫描激光共焦显微镜（需做说明）共轭焦显微镜的分类商业化的共聚焦（共轭焦显）显微镜（Conf70显微镜成像清晰度的决定因素:

1.分辨率

2.球差

3.色差显微镜成像清晰度的决定因素:1.分辨率

2.球差

3711、分辨率：

指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。1、分辨率：

指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能72人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率：0.20mm光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm电子显微镜分辨率：0.20nm人眼及各类显微镜的分辨率732、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。2、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上743、色差：

是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。3、色差：

是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色75共焦显微镜的几个关键技术共焦小孔光阑大小的选择：当小孔的直径等于艾利斑大小时既能保证共焦成像的高分辨率和层析能力，又有足够的光能通过小孔被探测器接收。高精度扫描系统的设计：目前主要采用的扫描方式主要有以下几种：（1）机械式工作台扫描2）光束扫描（3）Nipkow盘扫描4）光学扫描光学层析与图像重构算法：由探测器探测到的共焦信号是样品某个层面的反射光，通过改变聚焦深度即可以获得不同断层的光强信息，然后信号经过A/D转换变为数字量，以一定的图像格式存储到计算机中。每个断层的平面图像要经过图像平滑、图像增强等预期处理达到可进行三维重构的要求，再经过三维重构算法将各断层二维图像重构成三维图像。共焦显微镜的几个关键技术共焦小孔光阑大小的选择：当小孔76激光扫描共焦显微镜共聚焦扫描显微镜的系统组成硬件：

激光源共聚焦显微镜步近器检测器光电倍增管计算机图象输出设备（显示器彩色打印机）。软件：

显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统激光扫描共焦显微镜共聚焦扫描显微镜的系统组成77激光共聚焦显微镜构成激光器光电倍增管检测器显微镜步近器计算机电子图像软件激光共聚焦显微镜构成激光器显微镜计算机78激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜79共聚焦显微镜的特点光源共聚焦技术点扫描技术信号放大电子图像软件共聚焦显微镜的特点光源801、光源：激光

用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。

2、采用了共扼聚焦技术

在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。

3、点与面扫描技术

共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。

普通光镜：是在可见光源下一次性成像。

4、图像信号及处理：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。

计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。1、光源：激光

用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激81共扼聚焦原理图共扼聚焦原理图82

普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别

普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别83激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别84激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3.增加侧向分辨率4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响

激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别85激光共聚焦显微镜的优势在结构方面激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高可实现分层扫描可实现连续扫描，可动态记录变化可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像扫描速度快，对样品损伤小激光共聚焦显微镜的优势在结构方面86在应用方面形态观察--高清晰成像半定量--荧光强度分析荧光探针表达量测定定位研究--分层扫描多种荧光标记同时检测荧光标记物绝对定量分析扩展应用---如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等激光共聚焦显微镜的优势在应用方面激光共聚焦显微镜的优势87在效果方面

更灵敏：

共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。

定位更精确：

不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。显微镜扫激光共聚焦显微镜的优势在效果方面

更灵敏：

共聚焦显微镜采用了光电倍增技术88

定量测量：静态的定量测量

对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。动态的定量测量

共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。激光共聚焦显微镜的优势

在效果方面

定量测量：静态的定量测量激光共聚焦显微镜的优势

在效果89快速性：

由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。

数据图像可及时输出或长期储存：

用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。

激光共聚焦显微镜的优势

在效果方面

快速性：

由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短90牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像91牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像92鼠成纤维细胞单克隆anti–β-tubulin标记

高清晰成像鼠成纤维细胞高清晰成像93检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像94培养的293细胞绿色荧光蛋白高清晰成像培养的293细胞绿色荧光蛋白高清晰成像95共聚焦显微镜的应用高清晰成像半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定分层扫描荧光标记物绝对定量分析扩展应用共聚焦显微镜的应用高清晰成像96高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。可以清晰的表现某些细微结构。高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑97半定量荧光强度分析

荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。

荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。

随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。半定量荧光强度分析