基因突变与损伤修复

关于基因突变与损伤修复第一页，共四十七页，2022年，8月28日第一节基因突变的相关概念一、突变的概念

突变(mutation):基因结构的改变，导致表型的改变的变化突变体(mutant)：具有突变表型的细胞或个体正向突变(forwardmutation)：偏离野生型性状的突变反向突变(backmutation)：由偏离的性状回复为野生型性状的突变自发突变(spontaneousmutation)：在自然条件下产生的突变诱发突变(inducedmutation）：机体在诱发环境下产生的突变

第二页，共四十七页，2022年，8月28日

生化突变(biochemicalmutation）：使机体的代谢过程发生改变或丧失的突变无效突变(nullmutaion)：完全丧失原有基因功能的突变渗漏突变(leakymutation)：部分丧失原有基因功能的突变致死突变(lethalmutation)：影响生物体的生活力，导致个体死亡的突变条件致死突变(conditionallethalmutation)：在给定的某种条件下可以存活，如果缺少这种条件就会致死的突变第三页，共四十七页，2022年，8月28日二、突变类型

1.突变发生的细胞类型

体细胞突变(somaticmutation)Clone：无性繁殖。生殖细胞突变(germinalmutation)2.突变的表型:

(1)形态突变morphologicalmutaion(2)生化突变biochemicalmutaion(3)失去功能突变loss-of-functionmutation(4)获得功能突变gain-of-functionmutation(5)致死突变lethalmutaion(6)条件致死突变conditionallethalmutaion

第四页，共四十七页，2022年，8月28日三、突变的性质

1.稀有性:突变发生的频率很低突变率(mutationrate):在特定的条件下,单位时间间内(通常为一个世代),一个细胞发生某一事件的概率.高等真核生物自发突变概率为1/10-5—10-10。

2.可逆性：突变型可以恢复为野生型，通常由发生在第二个位点的突变所回复，如抑制基因→敏感因子。回复突变率一般小于正向突变率。可逆性区别于染色体的缺失。

3.多向性（随机性）：多方向，形成复等位基因。

第五页，共四十七页，2022年，8月28日第二节基因突变的分子基础一、自发突变(spontaneousmutation)

自发突变可能由复制错误、DNA损伤和转座作用等引起。

1.DNA复制错误(errorsofDNAreplication)

DNA碱基有互变异构体，造成DNA复制过程中的DNA错配。

ⅰ转换：Purine→Pu;或者Pyrimidine→Pyⅱ颠换：Pu→Py;或者Py→Puⅲ移码突变：增加或减少几个碱基,导致蛋白质翻译错位。

ⅳ缺失和重复：大片段碱基的缺失或重复，如E.coli乳糖发酵调节基因lacⅠ中四碱基重复序列。野生型:5‘-GTCTGGCTGGCTGGC-3’

突变型FS5:5‘-GTCTGGCTGGCTGGCTGGC-3’

突变型FS2:5‘-GTCTGGCTGGC-3’第六页，共四十七页，2022年，8月28日返回第七页，共四十七页，2022年，8月28日2.DNA损伤（lesions）

ⅰ脱嘌呤由于碱基和脱氧核糖间的糖苷键受到破坏,从而引起一个鸟嘌呤或腺嘌呤从DNA分子上脱落下来.ⅱ脱氨基C脱氨基变成U;A脱氨基变成H,：AA­T→→→H-T→→→H-C→→→H-C↘→A-T↘→G-CBG­C→→→G-U→→→A-U→→→A-U↘→G-C↘→A-T

造成转换

ⅲ氧化损伤（oxidativelesions）:O2-OH-H2O2

可对DNA造成损伤第八页，共四十七页，2022年，8月28日二、诱发突变（inducedmutaion）

多种理化因素都可以诱导DNA的突变1.诱变机制

ⅰ碱基类似物eg.5-BU和5-BrdU是胸腺嘧啶(T)的结构类似物，酮式结构易与A配对；烯醇式结构易与G配对。另有2-氨基嘌呤(2-AP,A类似物)、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶等。

ⅱ特异性错配

eg.烷化剂:甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍(NG)、芥子气等。通过改变碱基结构使碱基错配。如：G-C;当G烷基化后可与T配对，导致碱基转换。或者烷化剂使嘌呤脱落，造成转换、颠换、断裂或其他突变

第九页，共四十七页，2022年，8月28日ⅲ嵌合剂的致突作用

eg..吖啶类染料:吖啶橙、吖啶黄素、原黄素等碱基对的类似物，易造成移码突变。ⅳ辐射诱导效应

(1)紫外线UV:形成嘧啶二聚体，如T二聚体，①同一条单链内，影响复制时与A的配对，使复制中止；②双链之间，影响双链变性，并影响复制。重复、缺失、移码突变

(2)电离辐射：如X-ray、可引起碱基的降解或脱落，A变成H;C变成T，出现转换。物理——物理化学——生物化学——大分子损伤ⅴ黄曲霉的作用使鸟嘌呤G脱落，SOS修复引入A,造成突变。第十页，共四十七页，2022年，8月28日2.碱基替换的遗传效应

(ⅰ)同义突变（samesensemutation）不改变氨基酸的密码子变化，与密码子的兼并性有关.如GAU/GAC—Asp.(ⅱ)错义突变（missensemutation）碱基替换的结果引起氨基酸序列的改变.(ⅲ)无义突变（nonsensemutation）编码区的单碱基突变导致终止密码子(UAG/UGA/UAA)的形成,使mRNA的翻译提前终止,形成不完全的肽链.

如镰刀型贫血症：血红蛋白B链(146Aa)，6号氨基酸的替换,导致明显的表型症状。Glu→Val,若Glu→Asp则影响较小。第十一页，共四十七页，2022年，8月28日3.移码突变及其产生

在基因的外显子中插入或缺失1,2或4个核苷酸,使阅读信息发生错位,从而使翻译的蛋白质序列与原来完全不同.eg.E.coli中乳糖发酵的调节基因(lacⅠ):

野生型:5‘-GTCTGGCTGGCTGGC-3’

移码突变Ⅰ:5‘-GTCTGGCTGGCTGGCTGGC-3’

移码突变Ⅱ:5‘-GTCTGGCTGGC-3’4.突变热点和增变基因

基因中某些位点比其它位点突变率高，称突变热点。

Eg.分析T4-Phager

Ⅱ基因1500个突变体：rⅡA(1800bp)有200个位点；rⅡB(850bp)有108个位点。第十二页，共四十七页，2022年，8月28日形成原因：1.5-MeC的存在，5-甲基胞嘧啶(MeC)脱氨基后变成T,使G-C部位转变成A-T部位；2.短的重复序列的存在，容易配对错位，造成重复或缺失3.与诱变剂类型有关，不同诱变剂出现不同的热点。4.增变基因(mutatorgene)：该基因的突变会使整个基因组的突变频率增高，eg.A.DNA多聚酶基因，突变后使多聚酶的3’→5’校正功能降低或丧失，使基因组突变频率增高；

B.dam基因，突变后使碱基的错配修复功能降低或丧失，使基因组突变频率增高。第十三页，共四十七页，2022年，8月28日三、诱变与肿瘤

肿瘤的形成与否取决于机体中癌基因和抑癌基因的平衡，抑癌基因突变会致癌。一些诱变剂可以特异性的诱导抑癌基因突变，导致肿瘤发生。eg.黄曲霉素、UV(ultraviolet)等.

黄曲霉素可诱导P53基因G→T颠换，导致肝癌的发生；

UV可诱导P53基因5’-TC-3’发生C→T颠换，形成“T二聚体”，导致人类鳞状细胞皮肤癌的发生。四、定点诱变定义：利用人工合成的寡核苷酸，在离体的条件下，制造基因中任何部位的位点特异性突变的技术。反义遗传学（reversegenetics）:

合成—连接(单链M13)—复制—转化—检测第十四页，共四十七页，2022年，8月28日五动态突变（dynamicmutation）DNA序列中由于寡核苷酸拷贝数目的变化，引起生物表型改变的突变，称为动态突变。动态突变通常是由三联体密码子重复数目的增加而形成的。X脆性染色体综合症是由于在X染色体P27.3位置上CGG拷贝数目增加到200以上，引起基因的改变，形成痕迹很重的染色体，突变的部分很容易被打断，所以被称为是脆性染色体。第十五页，共四十七页，2022年，8月28日Fig6.11aThefragileXandanormalXchromosomefromafemale(left),andthefragileXandanormalYchromosomefromamale(right).©2003JohnWileyandSonsPublishersCredit:FromRichardsandSutherland,TrendsinGenetics,vol.8(7),p.249,1992.PhotocourtesyGrantSutherland.第十六页，共四十七页，2022年，8月28日脆性X综合症为X连锁遗传，出现几率在男婴中为1/2500，常由表型正常但带有一个主要成因可能是因为CGG三核苷片段重复数目的变化。第十七页，共四十七页，2022年，8月28日

三联体密码子的重复与疾病疾病密码子正常拷贝患者拷贝脊髓肌肉萎缩症CAG(gln)11-3340--62亨廷顿症CAG(gln)11-3442--100X脆性染色体CGG(arg)6-54250-4000强直型肌营养不良CTG(leu)7-2349-75小脑共济失调CAG(glu)4-1840-200第十八页，共四十七页，2022年，8月28日第三节生物体对突变的修复机制一光复活(photoreactivation)

1.概念：在可见光存在的条件下，在光复活酶作用下将UV引起嘧啶二聚体分解为单体的过程。

2.条件：可见光(300~600nm)、PR酶、嘧啶二聚体

3.作用过程：①光复活酶与T=T结合形成复合物;②复合物吸收可见光切断T=T之间的C-C共价键,使二聚体变成单体;③光复酶从DNA链解离.

*光复活是原核生物中的一种主要修复形式。第十九页，共四十七页，2022年，8月28日

光复活过程已在细菌、酵母、原生动物、哺乳动物乃至人类细胞中发现。第二十页，共四十七页，2022年，8月28日二切除修复1.概念:（核苷酸外切修复、暗修复）先在损伤的任何一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶将其连接起来。酶作用不需要光的激活，但黑暗不是必要条件。2.特点：消除由UV引起的损伤，也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。切除的片段可由几十到上万bp，分别称短补丁修复、长补丁修复。3.过程：①内切酶的作用在DNA损伤的一端,切开形成一个切口;②外切酶的作用将损伤部位切除;③聚合酶的作用将切口补齐,留下一个切口;④连接酶的作用将DNA连接形成完整的DNA链。第二十一页，共四十七页，2022年，8月28日4.特异性切除修复

E.coli中明显的损伤，可在UvrA、UvrB、UvrC的作用下得以修复，但不明显的损伤需要特异性修复。

(1)糖基化酶修复：如果碱基被共价修饰，糖基化酶可作用于C-N糖苷键，使碱基释放，产生无碱基(AP)位点,再由AP内切酶修复系统修复。

(2)AP内切酶修复系统修复：也由内切、外切、聚合和连接四种酶活性来完成，以修复AP位点。

**以上两种修复过程都没有涉及到DNA的重组,属于无误差的修复。第二十二页，共四十七页，2022年，8月28日p221切除修复有两种情况:一是先补后切,一是先切后补。一般认为先补后切比较合理。切除修复不仅能除去T=T,还可以除去DNA上的其它损害。第二十三页，共四十七页，2022年，8月28日三重组修复1.概念:通过对DNA的复制和同源链的重组，来完成对损伤部位的修复，又称复制后修复。2.特点:①修复过程伴随DNA的复制和重组；②仅修复新合成的不完整的单链，原先的损伤单链仍然保留；③部分重组蛋白的精确性差，修复的出错率较高。3.重组修复过程：

(1)复制：以损伤单链为模板复制时，越过损伤部位，对应位点留下缺口；未损伤单链复制成完整双链。

(2)重组：缺口单链与完整同源单链重组，缺口转移到完整链，使损伤单链的互补链完整，损伤单链仍然保留。

(3)再合成：转移后的缺口以新的互补链为模板聚合补齐。第二十四页，共四十七页，2022年，8月28日

重组修复并没有从亲代ＤＮＡ中除去T二聚体，在以后的复制中还必须经过重组修复的过程。但是随着复制的继续，损伤的ＤＮＡ链将在群体中逐步被“稀释”第二十五页，共四十七页，2022年，8月28日四SOS修复1.概念：是在DNA分子受损伤的范围较大而且复制受到抑制时出现的一种应急修复作用。2.可能的机理:过程①当DNA损伤较大时(如产生很多的T=T)，正常的DNA多聚酶复制到损伤位点时，其活性受到抑制；②短暂抑制后产生一种新的DNA多聚酶，催化损伤部位DNA的复制，由于新的DNA多聚酶的修复校正功能较低，新合成的碱基错配频率较高，易引起突变。3.特点：①修复系统需要在DNA分子受损伤的范围较大而且复制受到抑制时才能够启动。②修复系统对错配碱基的修复校正功能低下，从而增加突变的频率。第二十六页，共四十七页，2022年，8月28日③在紧急情况下，细胞通过一定水平的变异来换取细胞的幸存，有利于细胞逃生。

4.SOS系统的启动：通过操纵子(结构基因、启动子、操纵基因、调节基因)来实现：

A.SOS基因：recA基因、UvrA、UvrB、UmuC等，也称din基因(damageinduciblegene)，为操纵子的结构基因；

B.lex基因：阻遏蛋白基因，正常情况下结合在操纵基因上；

C.recA基因：重组蛋白基因，应急状态下启动蛋白质水解酶活性，水解阻遏蛋白，使din基因高效表达，从而启动SOS修复系统。第二十七页，共四十七页，2022年，8月28日五电离辐射损伤的修复①氢键断裂：DNA分子双链之间1.电离辐射效应*②共价键断裂：DNA单链断裂、双链断裂、碱基和糖基损伤③交联作用：DNA与DNA、DNA

与蛋白质之间发生2.电离辐射的修复：1、超快修复(0℃,2min)(E.coli)无O2、单链(DNA连接酶)2、快修复(几分钟)

其余90％断裂单链(聚合酶Ⅰ)3、慢修复(37℃,40-60min)

剩余单链(重组修复酶系统)第二十八页，共四十七页，2022年，8月28日六修复缺陷与人类疾病1.着色性干皮病(XP,xerodermapigmentosum)

位于1p的隐性基因控制，干性皮肤伴随神经系统疾病，由切除二聚体能力缺损造成。2.CockayneSyndrome(CS)

侏儒、视网膜萎缩。由缺损紫外线引起的DNA损伤修复系统引起。3.共济失调毛细血管扩张症4.早老症第二十九页，共四十七页，2022年，8月28日第三十页，共四十七页，2022年，8月28日第四节、基因突变的检测一、大肠杆菌突变体的检测

1.影印法——StrR突变体

单菌落→基本培养→所有菌落生长→挑选抗性菌落→抗性培养↘StrR培养→抗性菌落生长↗↓

(影印)StrR菌落

2.青霉素法——营养缺陷突变体野生型细菌→诱变处理→Pc培养→少数菌落生长→↘多数野生型细菌死亡!!!

基本培养突变型和少数野生型细菌→→营养缺陷菌落营养补充培养

↗↘↘↗（验证）第三十一页，共四十七页，2022年，8月28日二真菌营养缺陷型的检出菌丝过滤法——麦孢菌营养缺陷型

萌发菌丝→去除！分生孢子→诱变处理→液体通气培养→

(24h)

未萌发孢子→培养→萌发菌丝→去除！→萌发菌丝→去除！未萌发孢子→未萌发孢子→补充营养培养→营养缺陷型

说明：未萌发孢子——死亡、营养缺陷和少数野生型

↗↘

↗↘

↗↘第三十二页，共四十七页，2022年，8月28日三果蝇突变的检出1.性连锁基因隐性突变的检出(ClB法、Muller-5)

(1)ClB品系：C—交换抑制因子；l—隐性致死突变；B—棒眼检出步骤：A.将待测的♂果蝇与杂合（ClB/+++）♀果蝇杂交；

B.将F1ClB♀与F1♂（野生型）单对杂交，目的是检查某一特定X染色体上的突变；

C.观察分析：①有X隐性致死突变，F2

无雄蝇(♂:ClB和l’死亡);②隐性非致死突变，F2预期♀:♂=2:1，突变性状只在F2雄蝇表现，F1ClB中不表现；③无X隐性突变，在F2♂仅表现简单的♀:♂=2:1。第三十三页，共四十七页，2022年，8月28日

(2)Muller-5法：

A.Muller-5品系:B(棒眼)-Wa(杏眼)-sc(小盾片少刚毛)——并具重复倒位。

B.检出步骤:Ⅰ.将待测的♂果蝇与纯合Muller♀果蝇杂交.Ⅱ.将F1♀♂自交