单克隆抗体与基因工程抗体的制备

第四章

单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生二、单克隆抗体的纯化三、单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性第三节基因工程抗体制备一、人源化抗体二、小分子抗体三、抗体融合蛋白四、双特异性抗体五、噬菌体抗体库技术第四节单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂二、蛋白质的提纯三、小分子抗体的应用四、抗体融合蛋白的应用五、双特异抗体的应用六、抗体库技术的应用和前景思考题小结第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤

细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤

细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体流程一、杂交瘤技术不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重（二）免疫脾细胞细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠。淋巴细细胞。淋巴细细胞发发育。浆细细胞胞。抗原原接接种种培养养液液：：RPM1640培培养养液液DMEM培培养养液液（三三））细细胞胞融融合合细胞胞融融合合剂剂：：PEG:分子子量量4000的的PEG是是最最常常用用的的细细胞胞融融合合剂剂作用用机机理理：：诱导导细细胞胞膜膜上上脂脂类类物物质质结结构构重重排排，，使使细细胞胞膜膜易易打打开开而而有有助助于于细细胞胞融融合合作用用特特点点：：随机机发发生生的的，，不不同同厂厂商商、、批批号号、、分分子子量量的的PEG，，其其纯纯度度与与毒毒性性有有所所不不同同培养养骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞：：选择择对对数数生生长长期期的的细细胞胞进进行行传传代代培培养养细胞胞形形态态：：浑浑圆圆、、透透亮亮、、均均一一、、排排列列整整齐齐避免免细细胞胞返返祖祖：：定定期期用用8-AG处处理理细细胞胞注意意事事项项：：切切忌忌过过多多传传代代培培养养，，可可将将细细胞胞分分装装冻冻存存于于-80℃℃或或液液氮氮及及干干冰冰中中免疫疫脾脾细细胞胞的的制制备备：：1××108的淋巴巴细细胞胞无无菌菌手手术术饲养养细细胞胞：：细胞胞密密度度过过低低不不利利于于细细胞胞生生长长繁繁殖殖常用用小小鼠鼠腹腹腔腔细细胞胞作作饲饲养养细细胞胞其中中MQ还还有有清清除除死死亡亡细细胞胞的的作作用用饲养养存存活活一一般般不不超超过过2周周，，不不影影响响杂杂交交瘤瘤细细胞胞的的纯纯化化。饲养养细细胞胞骨髓髓瘤瘤细细胞胞与与淋淋巴巴细细胞胞(1:3)50%PEG1min内内加加完完;2min内内加加10ml培培养养液液融合合方方法法SP2/0细细胞胞与与脾脾细细胞胞的的比比例例为为1：：2～～51ml50%的的PEG（（无无菌菌，，预预温温37℃℃））在在1分分钟钟内内滴滴完完,静静置置90秒秒,时时间间一一到到,将将事事先先准准备备的的培培养养液液一一滴滴一一滴滴加加入入,停停止止PEG作作用用根据据细细胞胞数数量量加加入入HAT培培养养基基，，使使之之分分加加到到96孔孔板板中中时时每每孔孔细细胞胞数数为为（（0.5～～1.5））××105个。。融融合合后后7天天，，换换用用HT培培养养液液细胞胞融融合合10～～20天天出出现现克克隆隆HAT筛选选挑克克隆隆融合合细细胞胞的的早早期期培培养养HGPRT酶与与TK酶酶：：次黄黄嘌嘌呤呤磷磷酸酸核核糖糖转转化化酶酶胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷激激酶酶（四四））杂杂交交瘤瘤细细胞胞的的选选择择性性培培养养应用用液液：：8-杂杂氮氮鸟鸟嘌嘌呤呤聚聚乙乙二二醇醇HAT培培养养基基：：H（（Hypoxanthine））:次黄黄嘌嘌呤呤A（（Aminopterin））：：氨基基喋喋呤呤；；叶叶酸酸拮拮抗抗物物，，阻阻断断DNA合合成成主主要要途途径径T(Thymidine)：：胸腺嘧嘧啶啶核核苷苷；；““核核苷苷酸酸前前体体””，，供供细细胞胞通通过过替替代代途途径径合合成成DNAHAT选选择择作作用用：：淋巴巴细细胞胞：：不能能生生长长，，5~7天天死死亡亡；；DNA合合成成的的主主要要途途径径被被A阻阻断断骨髓髓瘤瘤细细胞胞：：不能生生长，，5~7天死死亡；；HGPRT缺缺乏，，DNA合合成的的替代代途径径受阻阻SP2/O:HGPRT-，，TK-;长长命脾细胞胞:HGPRT+，，TK+;短命(7天天)杂交瘤瘤细胞胞:HGPRT+，，TK+;长命骨髓瘤瘤细胞胞、脾脾细胞胞与杂交瘤瘤细胞胞杂交瘤瘤细胞胞：长期生生长繁繁殖利用淋淋巴细细胞的的HGPRT，，将H合成成为嘌嘌呤碱碱并最最终与与T一一起合合成DNA从淋巴巴细胞胞获得得产生生某种种抗体体的遗遗传信信息从骨髓髓瘤细细胞获获得不不断繁繁殖的的能力力有限稀稀释法法(limitingdilution)显微操操作法法(micromanipulation)FACS法法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂脂平板板法(softagarmethod)二、阳阳性杂杂交瘤瘤细胞胞的克克隆化化培养养与冻冻存特点：：不需任任何特特殊设设备克隆出出现效效率高高实验室室常用用方法法方法：：细胞悬悬液通通过系系列稀稀释每个培培养孔孔含0.5～1个细细胞有限稀稀释法法效率最最高价格昂昂贵FACS配制方方案：：杂交瘤瘤细胞胞（（（1～～5））x106/ml)+细细胞胞冻存存液(30%～～40%牛牛血血清，，50%～～60%RPMI-1640培培养液液，10%DMSO)“慢冻冻”：：分步冷冷冻，，30℃→→-70℃℃→液液氮“快融融”：：取出立立即浸浸入37℃℃～40℃℃水浴浴中，，使其其迅速速融化化、复复苏杂交瘤瘤细胞胞的冻冻存与与复苏苏防止污污染避免染染色体体丢失失防止非非分泌泌细胞胞的过过度生生长防止细细胞密密度过过高而而死亡亡细胞冷冷冻的的意义义第二节节单单克隆隆抗体体的制制备经过反反复克克隆化化获得得的抗抗体阳阳性杂杂交瘤瘤细胞胞株应应立即即扩大大培养养（除除及时时冻存存的细细胞外外）。。因多多次传传代易易引起起染色色体逐逐渐丢丢失而而使细细胞产产生抗抗体能能力逐逐渐减减弱甚甚至消消失，，还应应尽早早使用用获得得的抗抗体阳阳性杂杂交瘤瘤细胞胞株制制备单单克隆隆抗体体。一、单单克隆隆抗体体的产产生动物体体内诱诱生方方法：：每次用用BALB/c或F1代代小鼠鼠，（（5～～10）××105/只体外培培养法法：中空纤纤维培培养系系统单抗含含量不不高，，牛血血清Ab难难以去去除腹腔注注射法法前5天天进行行,预预先腹腹腔注注射pristane（1～～5））×106细胞1～3w形成成腹水水高滴度度腹水水可溶性性抗原原：ELISA抗体体捕获获法细胞、、亚细细胞结结构上上的抗抗原：：免疫荧荧光法法（用用丙酮酮和甲甲醇按按1:1比比例固固定细细胞））二、单单克克隆抗抗体的的纯化化ELISAELISA多头加加样枪枪。免疫荧荧光法法盐析沉沉淀亲和层层析离子交交换层层析McAb的的纯化化Ig类类型、、亚类类测定定：双扩法法或ELISA法特异性性测定定：抗原类类似物物的交交叉反反应效价测测定：：用腹水水或培培养液液的稀稀释度度表示示表位测测定：：几株单单抗是是否为为不同同表位位特异异的,用竞竞争争抑制制法，，相加加指数数法及及微机机集群群分析析亲和性性测定定：测定亲亲和常常数K杂交瘤瘤细胞胞染色色体：：秋水仙仙素裂裂解法法，小小鼠B细胞胞染色色体40条条，SP2/0细胞胞68条，，杂交交瘤细细胞一一般100多条条McAb靶靶抗原原分子子量：：常用westernblot三、单单克克隆抗抗体的的性质质鉴定定四、单单克隆隆抗体体的特特性高度特特异性性高度的的均一一性和和可重重复性性弱凝集集反应应和不不呈现现沉淀淀反应应对环境境敏感感性（一））单克克隆抗抗体的的特性性优点：：在体外外“永永久””地存存活并并传代代用相对对不纯纯的抗抗原，，获得得大量量高度度特异异的、、均一一的抗抗体。。适用用于以以标记记抗体体为特特点的的免疫疫学分分析方方法可用于于体内内的放放射免免疫显显像和和免疫疫导向向治疗疗（二））单克克隆抗抗体的的优点点与局局限性性局限性性：：固有的的亲和和性和和局限限的生生物活活性限限制了了它的的应用用范围围反应应强度度不如如多克克隆抗抗体制备技技术复复杂、、费时时费工工、价价格较较高McAbPcAb抗原要要求可以不不纯纯纯度高高得量高低低特异性性高低低稳定低高高沉淀反反应无有有成本高低低McAb与与PcAb的比较较McAbandPcAb第三节节基基因工工程抗抗体制制备基因工工程抗抗体(Geneticengineeringantibody)根据研研究者者的意意图，，采用用基因因工程程方法法，在在基因因水平平，对对免疫疫球蛋蛋白基基因进进行切切割、、拼接接或修修饰后后导入入受体体细胞胞进行行表达达，产产生新新型抗抗体。。主要要包括括嵌合合抗体体、单单链抗抗体、、人源源化抗抗体、、双价价抗体体和双双特异异性抗抗体。。将小鼠鼠Ig基因因敲除除，转转染人人Ig基因因，在在小鼠鼠体内内产生生人Ab，，再经经杂交交瘤技技术，，产生生大量量完全全人源源化抗抗体一、人源源化抗体体方法：从杂交瘤瘤细胞分分离出功功能性可可变区基基因，与与人Ig恒定区区基因连连接，插插入适当当表达载载体，转转染宿主主细胞，，表达人人-鼠嵌嵌合抗体体特点：减少了鼠鼠源性抗抗体的免免疫原性性保留了亲亲本抗体体特异性性结合抗抗原的能能力（一）嵌嵌合抗体体嵌合抗体体定义：指利用基基因工程程技术，，将人抗抗体可变变区（V）中互互补决定定簇（CDR））序列改改换成鼠鼠源单抗抗CDR序列。。重构成成既具有有鼠源性性单抗的的特异性性又保持持抗体亲亲和力的的人源化化抗体。。RAb亦叫““重构型型抗体””，因其其主要涉涉及CDR的““移植””，又可可称为““CDR移植抗抗体意义：多种特异异的鼠源源单抗有有可能应应用于临临床治疗疗（二）改改型抗体体Fab：：抗原结合合片断Fv：可变区片片段ScFv：单链可变变区片段段SdAb：单区抗体体二、小分分子抗体体小分子抗抗体其它生物物活性蛋蛋白融合合三、抗体体融合蛋蛋白许多抗原原抗体反反应要求求双价的的抗原结结合位点点，使抗抗原分子子上的两两个表位位交联或或使两个个抗原分分子连接接。将识识别肿瘤瘤抗原的的抗体和和识别细细胞毒性性免疫效效应细胞胞表面分分子的抗抗体连结结在一起起，可使使效应细细胞更容容易与肿肿瘤细胞胞结合识识别，取取得杀伤伤肿瘤细细胞的作作用。四、双特特异性抗抗体分别分离离纯化两两种不同同的McAb，，使各抗抗体解离离为单价价抗体，，再使两两种不同同抗原特特异性的的单价抗抗体通过过化学试试剂交联联起来，，然后分分离出目目的组分分。此法法缺点是是容易导导致抗体体失去活活性，产产物均一一性不佳佳。化学交联联BsAb将两种分分泌不同同特异性性单抗的的杂交瘤瘤细胞进进行再次次融合，，产生四四源杂交交瘤(quadroma)。但二次杂杂交瘤细细胞株分分泌的是是两套重重链，轻轻链的随随机组合合物。BsAb在其中中的比例例可为10%～～50%不等。。多倍杂杂交瘤细细胞的稳稳定性差差，BsAb的的产量少少且活性性低，费费时费力力，临床床应用时时存在人人抗鼠抗抗体免疫疫反应(HAMA)，因此此不适用用于临床床。细胞工程程BsAb多采用抗抗体分子子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基基因操作作修饰后后,或体体外组装装为BsAb,或直接接表达分分泌型的的BsAb。基因工程BsAb定义：将体外克隆的的抗体基因片片段插入噬菌菌体载体，转转染工程细菌菌进行表达，，然后用抗原原筛选即可获获得特异的单单克隆噬菌体体抗体。利用用这一技术可可以得到完全全人源性的抗抗体，在HIV等病毒感感染和肿瘤的的诊断与治疗疗方面有其独独特的优越性性五、噬菌体抗抗体库技术用PCR扩增增人抗体重链链可变区(VH)和轻链链可变区(VL)基因克隆到噬菌体体载体并以融融合蛋白的形形式表达在其其外壳表面用抗原抗体反反应筛选出表表达所需要抗抗体的克隆并并扩增。使抗体基因以以分泌的方式式表达，获得得可溶性的抗抗体片段。抗体库：组合抗体文库库：在建库过过程中如果将将VH和VL随机组合人天然抗体库库：抗体mRNA来源于于未经免疫的的正常人（一）基本原原理和程序噬菌体抗体库库从外周血或脾脾、淋巴结等等组织中分离离B淋巴细胞胞，提取mRNA并逆转转录为cDNA；应用抗体轻链链和重链引物物，根据建库库的需要通过过PCR技术术扩增不同的的Ig基因片片段；构建噬菌体载载体。噬菌体体抗体库载体体有λ噬菌体体、丝状噬菌菌体和噬菌粒粒三种，其中中后二者是目目前构建表面面表达的噬菌菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；表达载体转化化细菌，构建建全套抗体库库。通过多轮轮的抗原亲合合吸附-洗脱脱-扩增，最最终筛选出抗抗原特异的抗抗体克隆。构建噬菌体抗抗体库模拟天然全套套抗体库抗体文库可以以达到或超过过1011库库容,能包含含B细胞全部部克隆建库的外源基基因来自人体体多克隆细胞胞的总mRNA通用引物具有有人的种属普普遍性抗体的VH和和VL基因的的随机重组也也增加了抗体体的多样性（二）噬菌体体抗体库技术术的特点避开了人工免免疫和杂交瘤瘤技术抗体库的大容容量抗体库极高的的筛选效率可获得高亲和和力的人源化化抗体VH和VL基基因的随机重重组模拟了体体内抗体亲和和力成熟的过过程所用的抗体基基因又来自人人体第四节单单克隆抗体的的应用检验医学诊断断试剂蛋白质的提纯纯小分子抗体的的应用抗体融合蛋白白的应用双特异抗体的的应用抗体库技术的的应用和前景景病原微生物抗抗原、抗体的的检测肿瘤抗原的检检测免疫细胞及其其亚群的的检检测激素测定细胞因子的测测定一、检验医学学诊断试剂病原体测定：：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－－弓形虫,风疹疹病毒,巨细细胞病毒，，单纯疱疹病病毒细胞表面CD测定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型型激素的测定：：内分泌疾病的的诊断药物测定(TDM)：抗排斥药物抗抗肿瘤药物地地高辛研究工作中的的探针：越来越多未知知功能cDNA的克隆对复杂的基因因功能和多肽肽蛋白功能的的研究需求增增加免疫沉淀二、蛋白质的的提纯单克隆抗体是是亲和层析中中重要的配体体。将单克隆隆抗体吸附在在一个惰性的的固相基质（（如Speharose2B、4B、6B等等）上，并制制备成层析柱柱。当样品流流经层析柱时时，待分离的的抗原可与固固相的单克隆隆抗体发生特特异性结合，，其余成分不不能与之结合合。将层析柱柱充分洗脱后后，改变洗脱脱液的离子强强度或pH，，欲分离的抗抗原与抗体解解离，收集洗洗脱液便可得得到欲纯化的的抗原。MACS定义：分子量较小但但具有抗原结结合功能的分分子片段优点：分子量小,穿透性强强,抗原性性低不含Fc段段，不会与与带有Fc段受体的的细胞结合合，不良反反应少可在原核系系统表达及及易于基因因工程操作作半衰期短，，有利于及及时中和及及清除毒素素三、小分子子抗体的应应用应用：用于肿瘤的的导向治疗疗肿瘤的影像像分布基因治疗细胞内抗体体：在细胞内表表达特异性识别别某一基因因产物可干扰该基基因产物的的生物活性性研究基因结结构与功能能的关系肿瘤的体内内显像诊断断单链抗体排排除速度快快，穿透力力强，在肿肿瘤组织中中的分布指指数较完整整抗体分子子高放射显像时时，放射性性核素排除除较快，对对身体危害害程度小，，显像的本本底较低理想的显像像定位诊断断载体病毒的诊断断和抗病毒毒感染血液性疾病病的诊断白血病的免免疫诊断及及分型四、抗体融融合蛋白的的应用在体外免疫疫检测中的的应用自身红细胞胞凝集试验验快速检测HBV和HIV病原原体等避免化学交交联减低两两者的活性性，从而提提高酶免疫疫检测的敏敏感度用双特异抗抗体作为二二抗，检测测限达1ng/ml五、双特异异抗体的应应用在体内肿瘤瘤放射免疫疫显像诊断断中的应用用方法：双特异抗体体的一只臂臂结合靶抗抗原，一只只臂结合半半抗原螯合合剂，后者者可选择性性地与放射射性核素结结合，利用用二次导向向系统显示示特点：更高的的灵灵敏度和清清晰度在体内免疫疫治疗中的的应用抗体分子可可与放射性性核素、细细胞毒药物物、毒素、、等多种分分子相融合合，这些分分子在抗体体结合靶分分子后可提提供重要辅辅助功能双功能抗体体可有效针针对低水平平的肿瘤相相关抗原，，并将细胞胞毒物质输输送到肿瘤瘤细胞抗体还可与与携带药物物的脂质体体、各种PEG偶联联，从而增增强体内运运输和药代代动力学六、抗体库库技术的应应用和前景景在肿瘤体外外诊断中的的应用在肿瘤诊断断中的应用用在肿瘤治疗疗中的应用用1．杂交瘤瘤技术是如如何问世的的？其基本本原理是什什么？2．什么是是单克隆抗抗体？其特特性和局限限性如何？？与多克隆隆抗体有何异同同？3．杂交瘤瘤细胞的克克隆方法有有哪些？4．细胞株株冻融的原原则是什么么？5．大量制制备单克隆隆抗体的方方法有哪些些，各有哪哪些优缺点点？6．单克隆隆抗体的性性质鉴定的的方法有哪哪些？7．叙述单单克隆抗体体的制备流流程和应用用。8．叙述基基因工程抗抗体的概念念和优点。。9．基因工工程抗体的的种类和应应用。10．抗体体库技术的的原理和特特性有哪些些？思考题小结杂交瘤单克克隆抗体制制备技术的的原理是利利用聚乙二二醇作为细细胞融合剂剂，使免疫疫的小鼠脾脾细

胞与与具有在体体外不断繁繁殖能力的的小鼠骨髓髓瘤细胞融融为一体体，在HAT选择性性培养基的的作用下，，只让融合合成功的杂杂交瘤细胞胞生长，经经过反复的的免疫学检检测筛选和和单个细胞胞培养（克克隆化）,最终获得得既能产生生所需单克克隆抗体,又能不断断繁殖的杂杂交瘤细细胞系，将将这种细胞胞扩大培养养，接种于于小鼠腹腔腔，在其产产生的腹水水中即可得得到高效价价的单克隆隆抗体。20世世纪纪80年年代代诞诞生生了了应应用用DNA重重组组及及蛋蛋白白工工程程技技术术对对编编码码抗抗体体基基因因按按不不同同需需要要进进行行改改造造和和装装配配，，经经导导入入适适当当的的受受体体细细胞胞后后重重新新表表达达的的抗抗体体，，称称为为基基因因工工程程抗抗体体，，它它具具有有如如下下优优点点：：①①通通过过基基因因工工程程技技术术的的改改造造，，可可以以降降低低甚甚至至消消除除人人体体对对抗抗体体的的排排斥斥反反应应；；②②基基因因工工程程抗抗体体的的分分子子量量较较小小，，可可以以部部分分降降低低抗抗体体的的鼠鼠源源性性，，更更有有利利于于穿穿透透血血管管壁壁，，进进入入病病灶灶的的核核心心部部位位；；③③根根据据治治疗疗的的需需要要，，制制备备新新型型抗抗体体；；④④可可以以采采用用原原核核细细胞胞、、真真核核细细胞胞和和植植物物等等多多种种表表达达形形式式，，大大量量表表达达抗抗体体分分子子，，大大大大降降低低了了生生产产成成本本。。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Wednesday,December21,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。12:49:0312:49:0312:4912/21/202212:49:03PM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2212:49:0312:49Dec-2221-Dec-2212、故人江海海别，几度度隔山川。。。12:49:0312:49:0312:49Wednesday,December21,202213、乍乍见见翻翻疑疑梦梦，，相相悲悲各各问问年年。。。。12月月-2212月月-2212:49:0312:49:03December21,202214、他他乡乡生生白白发发，，旧旧国国见见青青山山。。。。21十十二二月月202212:49:03下下午午12:49:0312月月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月2212:49下下午午12月月-2212:49December21,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/2112:49:0312:49:0321December202217、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。12:49:03下下午12:49下午12:49:0312月-229、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。12月-2212月-22Wednesday,December21,202210、很多事情情努力了未未必有结果果，但是不不努力却什什么改变也也没有。。。12:49:0312:49:0312:4912/21/202212:49:03PM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2212:49:0312:49Dec-2221-Dec-2212、世世间间成成事事，，不不求求其其绝绝对对圆圆满满，，留留一一份份不不足足，，可可得得无无限限完完美美。。。。12:49:0312:49:031