分子生物学基因分析1

基因分析的基本技术1吉林大学白求恩医学院分子生物学教研室

CentralDogmaProteinDNARNATranslationTranscription脱氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid

碱基Base脱氧核糖核苷酸Deoxyribonucleotide：腺嘌呤（Adenine,A）胸腺嘧啶（Thymine,T）鸟嘌呤（Guannine,G）胞嘧啶（Cytosine,C）磷酸PhosphateOP-OO-OCH25'OOHH4'3'2'1'戊糖Pentose

H2OOHCH25'OH4'3'2'1'OPOOO5'OPOOO5'CH25'OH4'3'2'1'OPOOOCH25'OH4'3'2'1'OH3’,5’-Phosphodiesterbond脱氧核糖核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来，形成多核苷酸长链HOPOOOOPOOOOPOOOCH25'OH4'3'2'1'OH

ATGCDoubleHelixModelBasepairing：Sugar-phosphatebackbone脱氧核糖和磷酸交替连接排在外侧，构成基本骨架。碱基排在内侧，根据碱基互补配对原则通过氢键相结合，形成碱基对。FrancisCrickJmesWatson26-yr35-yrDNA分子由两条相互平行的脱氧核糖核苷酸长链盘绕而成NobelPrizeinPhysiologyorMedicine一.核酸印迹技术与分子杂交二.DNA芯片技术三.几种特殊的PCR技术Outline

一、核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridizationSouthern印迹（SouthernBlot）

Northern印迹（NorthernBlot）点杂交（DotBlot）原位分子杂交（insituhybridization）什么是核酸分子杂交（molecularhybridization）

以DNA的变性与复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。HighpHLowsaltHightemperature

氢键断裂是DNA的变性过程DNA变性：氢键断裂两条单链分开磷酸二酯键不受影响碱基排列顺序不变

互补单链重新形成氢键是DNA的复性过程lowpHhighsaltlowtemperatureDNA的复性：单链DNA在溶液中随机碰撞互补单链通过碱基配对形成氢键两条重新缠绕在一起的互补链不一定是原来的两条链

核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。

用带有标记的、已知序列的核酸片段

(单链RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量的一种方法。

核酸探针基因组DNA

探针：外显子区cDNA

探针：特异性高RNA探针：特异性高，本底低寡核苷酸探针：人工合成，检测突变类型：标记物：同位素:非同位素:32P，35S，3H

生物素、地高辛、荧光素DetectHybridsdenatureHybridizeAdddenaturedprobeDNA(labeled,complementarytothedesiredtemplate),Mix2.加入变性的探针DNA1.变性3.杂交4.检测杂交体

1.Southern

Blot1975年，英国人EdwinMellorSouthern创建①制备待测DNA样品、标记基因探针；②电泳分离待测DNA样品；③待测DNA样品的变性、转膜；④杂交；⑤显色。将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程，基本流程如下：

①.将内切酶消化的DNA片段进行电泳分离DNAIsolation

REDigestion

Agarosegelelectrophoresis②.

胶中的DNA经变性及中和后,转膜Neutralize

Blot：TransferDNAontoNCmembraneDNAisdenaturedbyNaOHSouthernBlot基本操作过程

转膜方法（1）（Note：Allthelayersarepressedtightlytogether）dry毛细管虹吸法Southern转膜示意图

转膜方法（2）电转法转膜装置示意图

标记的探针杂交袋将硝酸纤维素膜放入杂交袋中：预杂交:Pre-hybridization(Blocking)

杂交：与标记的核酸探针共孵育

(Hybridization)

洗膜：removeextraprobesboundtoNCmembrane放射自显影后的X光底片将硝酸纤维素膜与X-光片曝光④.检测杂交信号:

放射自显影（或显色）③.标记的探针与DNA的杂交Detectthehybridizationsignals:thepositionoftheannealedprobesignalonthemembrane.琼脂糖胶取下硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜

基因的定性分析Southernblot的用途

基因的定量分析如确定转基因鼠体内外源基因的拷贝数。

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将电泳分离的待测RNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上，然后与核酸探针杂交，进而定性分析mRNA。2.NorthernBlot确定特定基因的组织分布情况、确定基因的表达时相。28S18STotalRNAelectrophoresis基本程序：1、RNA的电泳2、转膜:将RNA转移到固相支持物上3、杂交:膜上的RNA的与探针的杂交4、检测杂交信号与SouthernBlot极为相似与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳:甲醛变性电泳转膜：不需变性

Northern杂交的探针可以是DNA，也可以是RNA。Northern杂交可以相对定量检测细胞内的特定mRNA表达水平。

优点：简单、快速、可同时检测多个样品

斑点杂交：将RNA或变性DNA样品点到一张硝酸纤维素膜上，并将膜按区域划分，点多个样品，烘烤固定，然后与特定探针进行杂交。3.DotBlot

4.原位分子杂交原位杂交（insituhybridization，ISH）：利用分子杂交技术进行基因及其表达产物定位分析。具备的条件：①组织、细胞或染色体的固定；②探针的制备：核苷酸序列+标记物。

（1）利用原位杂交技术进行基因定位分析荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）基因组原位杂交（genomeinsituhybridization，GISH）检测染色体、细胞和组织原位的DNA。判断特定序列是否存在或确定其在染色体上位置。鉴别、定位基因组DNA箭头所示为杂交信号样本制备→探针制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析

（2）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位RNA原位杂交整体原位杂交（Wholemountinsituhybridization,WISH）检测细胞、组织的原位RNA检测动物胚胎和分离器官的RNA

一、核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization分子杂交的基本原理、“探针”。1.SouthernBlot

（原理，过程，用途）2.NorthernBlot

（过程，用途）4.insituhybridization（FISH

）**ShortSummaryofthispart：3.DotBlot（特点）

二、DNA芯片技术DNAChipTechnologies

什么是DNA芯片技术DNA芯片（DNAchip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。大规模检测基因表达的最好方法之一

基因芯片工作流程

三、几种特殊的PCR技术RT-PCR

Real-timeqPCR

染色质免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitation,ChIP）

1.RT-PCR

——分析基因及其产物反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。

mRNAReverseTranscriptionPCROligo

dTAMVDNAPol1.RT-PCR

——分析基因及其产物

反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中，获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。广泛应用于基因表达检测和分子诊断。1.RT-PCR

——分析基因及其产物

看家基因的转录产物作为内掺照以证明各组间作为模板的总RNA的用量一致，例如：actin。Actin

内掺RT-PCR每个基因的引物设计：最好是外显子中间含有内含子！

2.Real-timeqPCR

—PCR技术可进行实时定量分析实时定量PCR技术（real-timequantitativepolymerasechainreaction,real-timeqPCR）是目前确定样品中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性及半定量分析实时PCR技术：

通过对PCR反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板（DNA/cDNA)浓度的定量分析。

探针TaqMan:水解型杂交探针与目标序列互补5’Reporter3’Quencher探针的5’端是报告荧光基团（Reporter)

,3’端是荧光素淬灭基团（Quencher）。荧光基团、淬灭基团距离较近：无荧光信号！

SYBRGreen实时定量PCR原理示意图

ThresholdlineC(t)value

Ct值：样品的荧光信号达到设定荧光域值时所经历的循环数荧光域值（Threshold)：在PCR曲线上人为设定的一个荧光强度值(T值)初始模板量越多,Ct值越小。每个模板的Ct值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系。

标准曲线：Ct值与起始浓度的对数成线性关系由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线，由此计算待测样品的初始模板浓度。

利用标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。

荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---循环数曲线.未知10410310610510210定量原理：5'3'RT-PCR3'5'探针标记

RReporter

QQuencher

RQ5'3'3'5'加热变性引物、探针与单链模板退火形成双链3'ExponentialgrowthCyclesofrealtimePCR024681012141618202224加热变性为PCR提供单链模板RQ探针PCR引物TaqDN