基因工程的基本工具和基本操作程序 【知识精讲+高效备课】 高考生物一轮复习 （新教材新高考）

核心知识全面复习高考一轮复习——选择性必修三《生物技术与工程》——第57讲基因工程的基本工具和基本操作程序1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三

种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。复习目标要求

考点一重组DNA技术的基本工具考点二基因工程的基本操作程序考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定主要考点

必备知识重组DNA技术的基本工具考点一

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。一.知识梳理

必备知识1.基因工程的概念苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白杀死害虫棉花细胞抗虫棉的培育

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。一.知识梳理

必备知识1.基因工程的概念

原理：基因重组。操作水平：分子水平。操作环境：生物体外。操作对象：基因。结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。②主要来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。①全称和简称全称——限制性内切核酸酶

简称——限制酶一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”③种类与命名现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶。资料卡：限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichiacoli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）中分离的第一种限制酶即_______SmaⅠ一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”GAATTCCTTAAG④特点：能识别双链

DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯键一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”⑤识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’

限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”⑥切割结果当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端；EcoRⅠ中轴线粘性末端平末端SamⅠ一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”

现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC*思考：你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端一.知识梳理

必备知识要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端供体生物细胞取出DNA限制酶目的基因思考：一.知识梳理

必备知识HindIII和EcoRI下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？各抒己见一.知识梳理

必备知识G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGC

TT

A

A

AA

T

T

C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？思考：一.知识梳理

必备知识G

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G如何将不同种来源的DNA片段连接起来？一.知识梳理

必备知识(2)DNA连接酶——“分子缝合针”2.重组DNA技术的基本工具①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一.知识梳理

必备知识(2)DNA连接酶——“分子缝合针”2.重组DNA技术的基本工具①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。T4

DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低一.知识梳理

必备知识(2)DNA连接酶——“分子缝合针”2.重组DNA技术的基本工具①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。种类E·coli

DNA连接酶T4DNA连接酶来源功能特性相同点大肠杆菌T4噬菌体只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）恢复的都是磷酸二酯键一.知识梳理

必备知识★思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用一.知识梳理

必备知识(2)DNA连接酶——“分子缝合针”2.重组DNA技术的基本工具①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

。DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键一.知识梳理

必备知识名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链归纳总结几种相关酶的比较(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具①作用：将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。②种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。拟核DNA质粒氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点大肠杆菌及质粒结构模式图(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”一.知识梳理

必备知识2.重组DNA技术的基本工具③作为载体需具备的条件a.有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。b.能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。c.常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。

在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点对受体细胞无害一.知识梳理

必备知识一.知识梳理

必备知识小积累标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。普通培养基不含抗生素选择培养基50µg/ml四环素一.知识梳理

必备知识一.知识梳理

必备知识例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。①或②①二.精题精练考向

基因工程工具酶的应用1.已知限制性内切酶XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列分别为C↓CCGGG和CCC↓GGG。有关这两种酶及应用的叙述，错误的是(

)A．这两种酶作用的底物都是双链DNAB．DNA中出现这两种酶识别序列的概率不同C．XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD．使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等B二.精题精练解析:限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，所以限制酶作用的底物是双链DNA分子，A正确；由题干可知，这两种限制酶识别的核苷酸序列相同，所以识别序列的机率相同，B错误；根据碱基互补配对原则，CCCGGG的互补链是GGGCCC，并根据XmaⅠ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—GGCC，C正确；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等，D正确。故选B。二.精题精练[对点训练]1．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，相关叙述错误的是(

)A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒B．两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对C．限制酶能使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开D．将重组质粒同时用2种限制酶切割会形成2种DNA片段D二.精题精练解析:由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确；由题干信息给出的两种酶的识别序列可知，两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对，B正确；限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，并具有专一性，C正确；将重组质粒同时用2种限制酶切割，标记基因和目的基因中的EcoRⅠ酶切割位点能被断开，则会形成3种DNA片段，D错误。故选D。二.精题精练考向基因工程载体的应用2.下列有关基因工程中载体的说法正确的是(

)A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因D解析:在基因工程中，天然的质粒不能直接作为载体，需要进行人工改造，A错误；不是所有的质粒都可以作为基因工程中的载体，质粒用作载体的基本要求是具有一至多个限制性核酸内切酶的识别位点和具有标记基因，B错误；细菌为原核生物，没有染色体，质粒是一种独立于染色体外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴别和选择的标记基因，D正确。故选D。二.精题精练[对点训练]2．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是(

)A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B．基因表达载体的构建并不一定相同C．图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因C二.精题精练解析:基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，A正确；由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，这样目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的，B正确；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，C错误。课堂练习：一、易错辨析1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(

)2.限制酶只能用于切割目的基因(

)3.限制酶也可以识别和切割RNA(

)4.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(

)5.E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(

)6.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因(

)××××××课堂练习：二、填空默写1.(选择性必修3P67)基因工程：_________________________________________________________________________________________________。2.(选择性必修3P71)限制酶能够识别双链DNA分子的

序列，并且使每一条链中特定部位的

断开。3.选择性必修3P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么_____________________________________________________________________________.②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？____________________________________________________________________________________按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品特定核苷酸磷酸二酯键

原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。

限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。课堂练习：二、填空默写4.(选择性必修3P72)载体上有特殊的标记基因，便于

。重组DNA分子的筛选5.选择性必修3P72：DNA连接酶和DNA聚合酶

(“是”“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是

，而DNA聚合酶是把单个的

连接到已有的DNA片段上。②

起作用时需要以一条DNA链为模板，而

不需要模板。不是两个DNA片段脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA连接酶6.不同种生物的基因能拼接的理论基础是：__________________________________________________________________________________________________________________________。7.外源基因在受体细胞内能表达的理论基础是：________________________________________________________________________________________________________。①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；②DNA分子都遵循碱基互补配对原则；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界共用一套遗传密码课堂练习：8.必修3P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶

(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是

，而DNA聚合酶是把单个的

连接到已有的DNA片段上。②

起作用时需要以一条DNA链为模板，而

不需要模板。不是两个DNA片段脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA连接酶二、填空默写基因工程的基本操作程序考点二一.知识梳理

必备知识培育转基因抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)一.知识梳理

必备知识基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前提核心关键保证一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取①目的基因概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。

根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因，如遇生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。也可以是一些具有调控作用的因子。一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取非编码区非编码区启动子编码区原核生物基因终止子补充知识：基因结构：非编码区

组成：编码区上游与编码区下游

功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达

启动子：RNA聚合酶结合位点转录起始的信号

终止子：终止RNA的合成编码蛋白质的合成一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取加工转录mRNA前体成熟mRNA真核细胞的基因非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345启动子终止子补充知识：基因结构：一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取②筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。获取目的基因的常用方法有哪些?从基因文库中寻找聚合酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知初始目的基因的来源1.从生物中直接获取2.人工合成注意：要保持基因的完整性一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库：含有一种生物的全部基因。部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。基因文库类型：③构建基因文库来获取目的基因一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。③构建基因文库来获取目的基因提取某种生物的全部DNA许多D一定大小的DNA片段导入受体菌中储存用适当的限制酶切将DNA片段与载体连接基因组文库基因组文库的构建模式图一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。③构建基因文库来获取目的基因某种生物特定发育时期的mRNA单链互补DNA双链DNA片段

反（逆）转录酶DNA聚合酶cDNA文库部分基因文库的构建模式图成熟mRNA与载体连接导入受体菌中储存文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以一.知识梳理

必备知识基因组DNA文库与cDNA文库的比较一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取需要仪器：DNA合成仪适用目的基因类型要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知（是否需要模板：不需要模板DNA合成仪方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因④利用化学方法人工合成一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取全称：聚合酶链式反应。原理：DNA半保留复制。操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪）。目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。优点：可以在短时间内大量扩增目的基因。PCR的概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。⑤利用PCR获取和扩增目的基因PCR扩增仪复制复制复制复制复制一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因复制起点解旋酶双链打开DNA聚合酶3’3’5’5’3’5’以母链为模板进行碱基互补配对解旋合成子链复旋游离的脱氧核苷酸知识回顾---DNA复制过程一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因ATCGAATCGGTT

UACCTTAGCCAADNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3′3′5′5′知识回顾---DNA复制过程一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因DNA体内复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链4种脱氧核苷酸解旋酶(体外用高温代替）DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内复制的引物为RNA单链。一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链4种脱氧核苷酸90℃以上高温耐高温的DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体外复制的引物一般为DNA单链。缓冲液（含Mg2+)：激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶不同的温度缓冲液:提供相对稳定的pH环境一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因复制的原料实为dNTP水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。

复制的原料实为dNTP,dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：ATCGP

~

P

~

P脱氧核糖含氮碱基磷酐键脱氧核苷酸一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因

目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。

第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物……。PCR过程：每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取DNA模板4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物5'3'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'变性当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合。延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。5'3'5'3'5'3'3'5'PCR过程：一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取⑤利用PCR获取和扩增目的基因呈指数形式扩增（n次扩增循环后，DNA数量约为2n）PCR结果：a.n代后，DNA分子有_____个

b.n代后，DNA链有_____条c.第____代出现完整的目的基因

d.n代后，含引物的DNA分子有_____个e.n代后，共消耗_____个引物f.第n代复制，消耗了______个引物g.n代后，完整的目的基因有_____个2n2n+132n2n+1-22n2n-2nPCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸（dNTPs）模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子一.知识梳理

必备知识PCR技术与细胞内DNA复制的比较生物材料DNAmRNA一定大小范围DNAPCRcDNA（互补DNA）基因文库基因组文库cDNA文库人工合成获取目的基因包括限制酶切割反转录一.知识梳理

必备知识1.目的基因的筛选与获取一.知识梳理

必备知识游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。解决办法？思考质粒细菌染色体植物染色体细胞核表达载体2.基因表达载体的构建一.知识梳理

必备知识①操作目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。②基因表达载体的构成启动子目的基因限制酶切割位点复制原点标记基因终止子（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）目的基因启动子终止子标记基因2.基因表达载体的构建一.知识梳理

必备知识启动子目的基因限制酶切割位点复制原点标记基因终止子启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。操纵基因结构基因

启动子RNA聚合酶本质:一段有特殊序列结构的DNA片段位置:位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点。特殊类型：诱导型启动子。诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达

。2.基因表达载体的构建一.知识梳理

必备知识启动子目的基因限制酶切割位点复制原点标记基因终止子终止子的功能：使转录在所需要的地方停下来。本质:一段有特殊序列结构的DNA片段。位置:位于基因的下游。标记基因的作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的重组DNA分子细胞筛选出来。常见类型:抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。一.知识梳理

必备知识启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）2.基因表达载体的构建一.知识梳理

必备知识质粒启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点限制酶目的基因限制酶切割位点限制酶获取目的基因连接酶重组DNA分子

载体（质粒）含有目的基因的DNA片段同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割带有黏性末端（或平末端）的切口带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）基因表达载体构建模式图3.将目的基因（重组质粒）导入受体细胞一.知识梳理

必备知识①将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。受体细胞：受精卵地位：我国科学家独创实例：将Bt基因导入棉花细胞3.将目的基因（重组质粒）导入受体细胞一.知识梳理

必备知识“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。①将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法一.知识梳理

必备知识种子植物裸子植物被子植物双子叶植物单子叶植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麦、玉米…双子叶植物－网状脉单子叶植物－平行脉一.知识梳理

必备知识农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞目的基因插入染色体DNA中植物细胞表现出新性状的植株植物组织培养一.知识梳理

必备知识农杆菌转化法示意图农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。3.将目的基因（重组质粒）导入受体细胞一.知识梳理

必备知识适用于单子叶植物

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。①将目的基因导入到植物细胞中方法--基因枪法3.将目的基因（重组质粒）导入受体细胞一.知识梳理

必备知识②将目的基因导入动物细胞——显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中（因为受精卵容易表现出全能性），这个受精卵将发育成具有新性状的动物。将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。显微注射将目的基因注射到动物受精卵中3.将目的基因（重组质粒）导入受体细胞一.知识梳理

必备知识（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。

优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞一般利用温度变化导入③将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法一.知识梳理

必备知识实例：利用转基因大肠杆菌生产药物

原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。一.知识梳理

必备知识生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、_________显微注射法

处理法受体细胞_______________________原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入受精卵Ca2＋花粉管通道法体细胞或受精卵4.目的基因的检测与鉴定一.知识梳理

必备知识检测—鉴定——3.检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等2.检测目的基因是否转录出了mRNA1.检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因①分子水平②个体水平4.目的基因的检测与鉴定一.知识梳理

必备知识①分子水平(1)首先取出转基因生物的基因组DNA；检测目的基因:DNA分子杂交(2)将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；(3)

使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。基因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。变性变性4.目的基因的检测与鉴定一.知识梳理

必备知识①分子水平检测目的基因是否转录出了mRNA:DNA分子杂交

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。检测表达的蛋白质:抗原—抗体杂交补充思考：在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？抗原4.目的基因的检测与鉴定一.知识梳理

必备知识②个体水平转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未侵染上病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常一.知识梳理

必备知识二.精题精练考向

目的基因的获取D1.依次为EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体示意图，下列有关叙述正确的是(

)A．DNA片段被BamHⅠ、Sau3AⅠ酶切后可形成不同的黏性末端B．不能使用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ获取目的基因C．抗生素抗性基因可用于鉴别目的基因是否表达D．使用限制酶EcoRⅠ、Sau3AⅠ切割质粒可防止自身环化二.精题精练解析:DNA分子被BamHⅠ、Sau3AⅠ酶切后得到的黏性末端是相同的，A错误；使用EcoRⅠ和BamHⅠ获得的目的基因可整合到表达载体的启动子和终止子之间，可用二者获得目的基因，B错误；只要表达载体导入了受体细胞，受体细胞就是有抗药性，目的基因是否表达，也需要进一步鉴定，C错误；使用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割质粒，由于黏性末端不同，可防止质粒自身环化，D正确，故选D。二.精题精练[对点训练]1．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述错误的是(

)A．图中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNAD二.精题精练考向

基因工程的基本操作程序2.2020年3月16日，中国科学家陈薇院士团队研制的重组新冠疫苗通过临床研究注册审评，获批进入临床试验。重组新冠疫苗的制备流程如图。回答下列问题。(1)步骤②需要____________作为原料。步骤③需要的工具酶主要是________。(2)被用作载体的Ad5应具有的特点是________________________________________________________________________(答出1点即可)。脱氧核苷酸Taq酶

能自我复制(或有一个或多个切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害)二.精题精练(3)步骤④是______________________。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为________，刺激机体产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件之一是_____(填“有”或“无”)SARS－CoV－2感染史，理由是_______________________________________________________________________________。(5)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需进一步试验，请写出试验思路：________________________________________________________________________________。基因表达载体的构建抗原无

有SARS－CoV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相应抗体，会对试验结果产生干扰

给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样并检测相应抗体的水平二.精题精练解析:(1)步骤②为逆转录过程，合成的产物是cDNA，因此需要脱氧核苷酸作为原料。步骤③为利用PCR技术扩增获得S蛋白基因的过程，该过程需要的酶是Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)。(2)Ad5作为载体应具有的特点是能自我复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、在宿主细胞中可以存活并表达、对宿主细胞无害等。(3)步骤④为构建目的基因表达载体的过程，即重组新冠疫苗的过程。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白可作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，使机体免疫系统产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足无SARS－CoV－2感染史的条件，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感染过新冠病毒的人体内含有相应的记忆细胞，若注射疫苗，则会出现二次免疫的特征，即体内的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，浆细胞合成并分泌大量的抗体，从而导致无法检测出该疫苗的真正效果。(5)实验目的为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，根据实验目的可知，该实验的自变量为疫苗的注射剂量，因变量为抗体产生量，因此设计实验如下：将同性别且年龄相当的志愿者随机分成若干组，然后给不同组别的志愿者注射不同剂量的疫苗，一段时间之后，检测志愿者体内的抗体产生量，作好记录并进行比较、分析，从而得出结论。二.精题精练[对点训练]2．通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(1)人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为________刺激机体发生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗先后需要接种多次，其目的是__________________________________。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核苷酸序列，但推测出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是_______________________________________________________________________。抗原

使人体产生更多的抗体和记忆细胞

决定氨基酸的密码子具有简并性(或决定一种氨基酸的密码子往往不是只有一种)二.精题精练[对点训练]2．通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(3)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一过程中需要的工具酶主要有___________________。构建的基因表达载体中，编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因应该位于____________之间。(4)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以稳定遗传的关键是___________________________________________________________________。限制酶和DNA连接酶启动子和终止子

确保编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上二.精题精练解析:(1)乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接种多次的目的是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密码子具有简并性，根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推测出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在构建基因表达载体过程中，需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用DNA连接酶把目的基因与载体连接起来。构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序列，目的基因需要插在启动子和终止子之间。(4)真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将目的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。课堂练习：一、易错辨析1.目的基因就是指编码蛋白质的基因(

)2.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(

)3.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(

)4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达(

)5.应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达(

)×√√√×课堂练习：二、填空默写1.选择性必修3P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈

，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。酸性2.(选择性必修3P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供

、

、4种

和耐高温的

。DNA模板2种引物脱氧核苷酸DNA聚合酶3.(选择性必修3P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有

等。4.(选择性必修3P81)转化：__________________________________________________________。启动子、终止子目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程课堂练习：二、填空默写5.据图回答问题：构建基因表达载体的目的是___________________________________________________________________________________________。一个基因表达载体的组成包括_____________________________

等。图中抗生素抗性基因的作用是_____

，

。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用目的基因、启动子、终止子及标记基因作为标记基因便于重组DNA分子的筛选课堂练习：二、填空默写7.择性必修3P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈

，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。酸性DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定考点三一.知识梳理

必备知识提取生物大分子的基本思路：

选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。1、DNA的粗提取与鉴定一.知识梳理

必备知识提取原理（1）利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（2）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度1、DNA的粗提取与鉴定鉴定原理

在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。

DNA+二苯胺沸水浴蓝色实验材料的选取

原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。一.知识梳理

必备知识1、DNA的粗提取与鉴定

供选材料：新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）（括号内为染色体条数）原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑;选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。思考：能否选用新鲜的猪血作为提取DNA的材料？一.知识梳理

必备知识(1)操作流程取材、研磨:称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL

研磨液，充分研磨。(1)研磨的目的

破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中(2)研磨时间不宜太长

防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶

研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力1、DNA的粗提取与鉴定一.知识梳理

必备知识过滤或离心取上清液：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？

可能含有核蛋白、多糖等杂质②低温放置几分钟的作用

可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；(2)操作流程1、DNA的粗提取与鉴定一.知识梳理

必备知识预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA

在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子(2)酒精预冷的作用:同“低温放置的作用”(2)操作流程1、DNA的粗提取与鉴定一.知识梳理

必备知识NaCl溶液溶解DNA并鉴定

取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关加入2mol/L氯化钠溶液不加入丝状物加入4ml二苯胺试剂加入2mol/L氯化钠溶液加入丝状物加入4ml二苯胺试剂实验组对照组水浴加热(2)操作流程1、DNA的粗提取与鉴定一.知识梳理

必备知识2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验原理①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。一.知识梳理

必备知识(2)实验步骤移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。混合：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。DNA片段的扩增一.知识梳理

必备知识反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。(2)实验步骤DNA片段的扩增一.知识梳理

必备知识DNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。制备凝胶①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极。(2)实验步骤凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来一.知识梳理

必备知识加样

将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。电泳：

接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。DNA片段的电泳鉴定(2)实验步骤一.知识梳理

必备知识观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。DNA片段的电泳鉴定(2)实验步骤注意事项

(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。二.精题精练考向DNA的粗提取与鉴定A1.如图是“DNA粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述错误的是(

)A．图1中溶液a是0.14mol·L－1的NaCl溶液B．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶C．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显D．图2试管1的作用是证明2mol·L－1NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色二.精题精练解析：图1中溶液a是2mol·L－1的NaCl溶液，A错误；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，B正确；图2所示实验操作中有一处明显错误(试管2中未将DNA溶于2mol·L－1的NaCl溶液中)，可能导致试管2中蓝色变化不明显，C正确；图2试管1的作用是证明2mol·L－1NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，D正确。故选A。二.精题精练[对点训练]1．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：

(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？_____________________。(3)在沸水浴中加热的目的是_____________，同时说明DNA对高温有较强的________。(4)A试管在实验中的作用______。(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________有关。溶液不变蓝色溶液颜色基本不变溶液逐渐变蓝色DNA在沸水浴的