苏云金芽孢杆菌生物农药的制备、伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性

PAGEPAGE2JIUJIANGUNIVERSITY实验论题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性院系生命科学学院专业生物技术姓名樊晓乐、严学芬、王伟、周明宣、邹红虹班级B0933指导教师张炳火二零一一年十一月PAGEPAGE5摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性前言苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。1材料与方法1.1菌种苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。1.2培养基种子培养基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl1.0%,调pH7.2左右,121℃灭菌30min。发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白质1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl0.2%,MgSO4·7H2O0.03%,K2HPO40.03%,MnSO40.005%,调pH7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH7.3。1.3实验仪器与药品实验仪器：培养皿，离心机，试管，接种针，移液枪，高压蒸汽灭菌锅。实验药品：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，MgSO4·7H2O，K2HPO4，MnSO4。1.4培养方法1.4.1种子液的培养将苏云金芽孢杆菌孢子接入种子培养基中培养1.4.2菌株发酵将种子培养基中的苏云金芽孢杆菌接入发酵培养基中进行发酵1.4.3Bt制剂的制作将苏云金芽孢杆菌离心获得蛋白质粗制品1.5苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的分离纯化将裂解得到的溶液冷冻离心（4℃、4000r/min）30min后，除去上清液，将芽孢与伴孢晶体充分分离。用无菌水洗涤沉淀，除去剩余的芽孢与杂质。用0.5mol/LNaCL洗涤沉淀，消除晶体中内生蛋白酶对晶体的被特意降解。得到的悬液继续沉淀30min，去除上清液，像沉淀中加1mol/LNaCL+0.01%TritionX-100制成孢晶悬液，在0~4℃静置24h。将静置后的悬浮液离心，然后溶于0.001mol/LNaCl+0.01%TritionX-100+2%甘油中，静置10min离心，沉淀制成水悬液。将利用高速离心法得到的水悬液装入透析袋中透析4h，已除去高速离心中引入的盐杂质，再放入冰箱中冷冻过夜，即得到淡黄色的伴孢晶体粉末。1.6伴孢晶体蛋白对菜青虫的防治试验1.在菜地取三个边长为20cm的正方形，分别做标记为Bt制剂、伴孢晶体和对照。2.按照标记分别撒上Bt制剂、伴孢晶体和无菌水。3.十五天后观察并记录分别撒上Bt制剂、伴孢晶体和无菌水的白菜的长势，统计眼虫数量。2结果与分析2.1Bt制剂将培养液转移到离心管中4000r/min离心30min，收集沉淀，用0．5mol／LNaC1和生理盐水各洗涤1次，离心(4000／min)30min，收集沉淀，取一半沉淀，与适量土混合，放在恒温干燥箱中，即得。2.2伴孢晶体的提取及晶形检测取另一半沉淀，称沉淀重量，以0.070g／mL加入蒸馏水混匀转入烧杯中进行磁力搅拌，除去泡沫，然后转入分液漏斗中，按体积比悬液：1％Na2SO4：CCl4=7:6:7，加入振匀10min，静置8min．将水相吸出离心(4800r/min)10min，去上清液，沉淀每管用5％的丙酮洗涤离心(4800r/min)10min重复3次．再用蒸馏水洗涤离心(4000r／min)10min3次，得沉淀晶体蛋白透析脱盐，将沉淀真空冷冻干燥-4℃保存备用．2.3Bt制剂及伴孢晶体对菜青虫的防治效果表1Bt制剂及伴孢晶体对菜青虫的防治效果稀释倍数Bt制剂伴孢晶体对照(无菌水)死亡个数961死亡率90%60%1%平均相对死亡率90%60%1%1）空白对照组：小白菜长势不佳，对照菜地上白菜有20个虫眼。2）Bt制剂组：小白菜长势良好，实验白菜上有8个虫眼。3）伴孢晶体菌悬液组：小白菜长势好，实验白菜上仅有2个虫眼。3结论与讨论1.根据试验结果表明固体发酵培养制备Bt制剂比较适宜，但对于制备伴孢晶体而言，相对于用液体发酵培养制备的杀虫效果略差；2.Bt制剂和伴孢晶体菌悬液对小菜蛾虫都有很好的杀虫活性，杀毒15d，分离纯化后的伴孢晶体的杀虫活性比Bt制剂要好。参考文献1．马虹，黄洁夫-苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取方法比较研究-湖南师范大学自然科学学报2.湖南师范大学自然科学学报-苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取方法比较研究3.罗志军．Bt毒蛋白基因工程研究进展[J]．重庆师专学报，2000(2)：89～914.朱仕房，杨曜中．双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究EJ]，世界农药，2000，22(