分子生物学实验技术

分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二 质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六 植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13DNA15实验十一 感受态细胞的制备及转化16实验十二克隆的筛选和快速鉴定18实验十三DNA分析——Southern杂交19—基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定DNARNA二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达DNA实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。3000kb20~30min1×109~2×109/mL。培养基。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化钠4、1mol/LNaOH5、琼脂粉6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1、培养皿2、带帽试管3、涂布器4、灭菌锅5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6、恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入细菌培养用胰蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/LNaOH调节pH位至7.0。加入去离水至总体积为lL，在15 lbf／in2(1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。（二）细菌的培养（１）在液体培养基中培养1、过夜培养⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。60r/min37℃２、大体积培养1∶1005⑵于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。（２）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单落和短期保存。平板划线法分离单菌落⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。⑶于37℃培养直至长出单菌落。实验二 质粒DNA的提取目的原理质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。DNADNADNADNADNADNADNADNADNApH=4.8pHDNADNADNARNA、蛋白质-SDS一起沉淀下来而被除去。试剂与器材一、试剂1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解于1000mLNaOHpH7.520min。2、LB1000mLLB15g20min。3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-HCl(pH8.0)。4、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH,1%SDS。（必须现配）5、溶液Ⅲ：pH4.8（5mo1／L60mL，mL28.5mL）。6、TE缓冲液（pH8.0）：10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA。770%二、器材1、Eppendorf管、离心管架2、10，100，1000ul微量加样器3、台式高速离心机4、摇床、高压灭菌锅5DH5α（含质粒操作步骤一、培养细菌LB，37℃×24h，5mL，37℃×12h。二、提取步骤11.5ml离心管，8000rpm×1min，残液。2100ul34ulRNase，室温×2min。4200ul5min粘稠。5150ul预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），min。6、12000rpm×5min。转移上清液至另一1.5ml离心管中。7、上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃×20min。8、12000rpm×5min，彻底除去残液。9500ul70%DNA3000rpm×1min，彻底挥发除去乙醇。10、加入40ulddH2O溶解DNA，待用。（或用TE溶解，-20℃保存）。实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度一、目的DNARNA二、原理核酸分子中的碱基集团含有共轭双键，它们对紫外光有强烈的吸收。核酸的260nm230nm。可以利用核酸的这一特性对其浓度260nm，A260=1DNA50μg/ml，单链DNA为33μg/ml，RNA40μg/ml，寡聚核苷酸为20～30μg/mlA260DNAA260/A280=1.8,纯的RNAA260/A280=2.0.中含有蛋白或其它杂质会使其比值下降。三、试剂与仪器（一）试剂TE（二）仪器紫外分光光度计四、操作步骤1、开机，选择波长20260nm2、选择A档，调零4AATETE3、测定样品TEA2604、计算样品的浓度DNA=50μg/ml×A260×DNA=33μg/ml×A260×RAN=40μg/ml×A260×核酸总量=样品浓度×样品体积（ml