DNA重组技术的工具

DNA重组技术的基本工具专题1-1怪物1怪物2怪物3怪物4思考：以上这些构想，传统的育种方法能否实现？这就要用到定向改造生物的新技术

——基因工程基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。操作对象：操作水平：结果：DNA重组技术和转基因技术分子水平基因重组操作环境：主要技术：原理（变异类型）人类需要的生物类型和生物产品基因生物体外苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉为什么能把苏云金芽孢杆菌的基因“嫁接”到棉花上并成功表达？1、所有生物的的DNA都是以4种脱氧核苷酸为基本单位，构成独特的双螺旋结构，这为不同生物DNA拼接提供了物质基础。2、地球上的所有生物共用一套遗传密码。基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA导入形成基因工工程培培育抗抗虫棉棉的关关键步步骤：：关键步步骤一一：抗虫基基因从从苏云云金芽芽孢杆杆菌细细胞内内提取出出来关键步步骤二二：抗虫基基因与运载载体DNA“缝合””关键步步骤三三：抗虫基基因进入棉棉花细细胞解决培培育抗抗虫棉棉的关关键步步骤需需要哪哪些工工具？？“分子手手术刀刀”——限制性性核酸酸内切切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝缝合针针”——DNA连接酶酶“分子运运输车车”——基因进进入受受体细细胞的的载体1.1、DNA重组技技术的的基本本工具具一、““分子子手术术刀””———限制制性核核酸内内切酶酶（简称称限制酶酶）原核生生物这类酶酶存在在于原原核生生物中中有什什么作作用呢呢？1、主要要来源源：原核生生物容容易受受到自自然界界外源源DNA的入侵侵，限限制酶酶是一一种防防御工工具，，当外外源DNA侵入时时，会会利用用限制制酶将将外源源DNA切割掉掉，使使之失失效，，保证证自身身的安安全。。为什么么细菌菌中限限制酶酶不剪剪切细细菌本本身的的DNA？即一种种限制制酶只只能识识别一一种特特定的的核苷苷酸序序列，，并且且能在在特定定的切切点上上切割割DNA分子。。3、作用用机制制：4000种。2、种类类：因为含含有某某种限限制酶酶的细细胞，，其DNA分子中中或不不具备备这种种限制制酶的的识别别序列列，或或通过过甲基基化酶酶将甲甲基转转移到到所识识别序序列的的碱基基上，，使限限制酶酶不能能将其其切开开。限制酶酶特点：：专一一性作用部部位：：磷酸酸二酯酯键（1））黏性性末端端被限制制酶切切开的的DNA两条单链的的切口口，带有有几个个伸出的的核苷苷酸，他们们之间间正好好互补配配对，这样样的切切口叫叫黏性末末端。4、结果果：形成两两种末末端黏性末端平末端EcoRⅠⅠ黏性末末端黏性末末端EcoRⅠⅠ黏性末末端黏性末末端EcoRⅠⅠ能识别别GAATTC序列，，并在在G和和A之间间切切开开SmaⅠⅠ平末末端端（2））平平末末端端平末末端端SmaⅠⅠ能能识识别别CCCGGG序列列，，并并在在C和和G之间间切切割割形形成成平平末末端端当限限制制酶酶从从识识别别序序列列的的中中心心轴轴线线处处切切开开时时，，切切开开的的DNA两条条单单链链的的切切口口，，是是平平整整的的，，这这样样的的切切口口叫叫平末末端端。GAATTCCGTAGAATTCGGATT尝试试写写出出下下列列序序列列受受EcoRI限制制酶酶作作用用后后的的黏黏性性末末端端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTAAGGCATCTTAAGCCTAACTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATT练一一练练:GGCATCTTAAAATTCCGTAG目的的基基因因被同同一一种种限限制制酶酶切切断断的的几几个个DNA是否否具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端？？思考考:要想想获获得得某某个个目的的基基因因必须须要要用用限限制制酶酶切切几几个个切切口口？？可可产产生生几几个个黏黏性性末末端端？？一一个个目目的的基基因因有有几几个个黏黏性性末末端端？？要切切两两个个切切口口，，产产生生四四个个黏黏性性末末端端，，两两个个。。是，，会会产产生生相相同同的的黏黏性性末末端端。。DNA被限限制制酶酶切切断断后后有有两两个个反反向向互互补补的的“黏性性末末端端”。被被同同一一种种限限制制酶酶切切断断的的几几个个DNA具有有相相同同的的黏黏性性末末端端，，能能够够通通过过互互补补进进行行配配对对。。分子子缝缝合合针针：：DNA连连接接酶酶G

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G用同种限制酶切割二、、分分子子缝缝合合针针────DNA连连接接酶酶1、作作用用：：将将互互补补配配对对的的两两个个黏黏性性末末端端连连接接起起来来，，使使之之成成为为一一个个完完整整的的DNA分分子子。。AATTGCCTTAAG连接接磷磷酸酸二二酯酯键键可把把黏性性末末端端之间的缝隙“缝合””起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶酶切开的两个个核苷酸之间间的磷酸二酯酯键2、类型T4DNA连接酶还可把平末端之间的的缝隙“缝合合”起来，但效率率较低T4DNA连接酶类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的的核酸片段上上，形成磷酸酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯酯键连接成一条互互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时时连接起来，不需要模板三、基因的运运输工具——运载体3.种类：质粒、λ噬菌体的衍衍生物和动植物病毒毒。1.作用：将外源源基因送入受受体细胞。能在宿主细胞胞内复制并稳稳定地保存。。具有一个至多多个限制酶切切点，使外源源基因插入其其中。具有某些标记记基因，以便便进行筛选。。如抗菌素抗性性基因、产物物具有颜色反反应的基因等等。对受体细胞无无害，不影响响其正常活动动。2.条件：质粒病毒(噬菌体和动植植物病毒)最常用的运载载体——质粒分布：存在于于许多细菌以及酵母菌等生物中。最常用的质粒粒是大肠杆菌的质质粒。本质：细胞染染色体(或拟核)外能自主复制的小型型环环状DNA分子。质粒的存在与与否对宿主细细胞生存没有有决定性作用用，但复制只只能在宿主细细胞内完成。。注意：真正用用作运载体的的质粒都是人人工改造过的的。基因的运输工工具——质粒能复制并带着着插入的目的的基因一起复复制有切割位点有标记基因的的存在，将来来可用含青霉霉素的培养基基鉴别。小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒1、质粒是基基因工程中最最常用的运载载体，它的主主要特点是①能自主复制制②不能能自主复制③