DNA重组培训讲义

第五章DNA重组同源重组Homologousrecombination

位点专一性重组Site-specificrecombination

转座重组Transposition生物进化需要可遗传的变异不断产生,变化的根本原因是突变,但就每个个体而言发生突变的几率毕竟很低。涉及到的基因数目非常有限，如果只有突变而没有不同个体间的基因交流，则生物体难以迅速组装产生最能适应环境条件的基因组合。而且，通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性，从而为选择奠定物质基础。第一节同源重组

Homologousrecombination

同源重组指由两条同源区的DNA分子，通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程。真核生物非姐妹染色单体之间的交换，姐妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转导、接合、噬菌体的重组都属于这一类型。其中，E.coli等细菌的同源重组又称为依赖RecA的重组。真核生物同源重组也称交换（crossingover），是指减数分裂（meiosis）过程中染色体间遗传物质的交换。其特征是发生在同源DNA序列之间。重组酶能以两个DNA分子中任何一对同源序列作底物进行交换。特征涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成存在重组热点需要重组酶单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号一、同源重组的分子模型1、断裂-复合Breakageand

reunion2、异源双链

在重组位点上，每个双链都有一个由两个亲本DNA分子中的一股单链共同组成的双链区域，这段区域称为异源双链DNA（heteroduplexDNA）3、分支迁移

两个双螺旋形成的交叉连接很容易以拉链式效应扩散，也就是链交换可沿着双链滑动，这个过程称为分支迁移（branchmigration）4、、Holliday结结构构重组组中中连连接接两两个个DNA双双链链的的交交换换中中间间物物含含有有4股股DNA链链，，在在其其连连接接处处为为了了转转换换配配对对所所形形成成交交叉叉链链的的连连接接点点称称为为Holliday结结构构。。5、、连连接接分分子子的的拆拆分分链交交换换形形成成的的连连接接分分子子必必须须拆拆分分（resolution）），，彼此此分分离离为为双双链链DNA分分子子。。由由于于交交联联在在一一起起的的两两条条双双链链DNA分分子子实实际际上上处处在在不不断断地地异异构构化化中中，，切切口口可可能能在在两两对对同同源源链链中中任任意意一一对对上上发发生生。。根据据链链裂裂断断切切开开的的方方式式不不同同，，得得到到的的重重组组产产物物也也不不同同。。如如果果切切开开的的链链并并非非原原来来断断裂裂的的链链，，重重组组体体异异源源双双链链区区的的两两侧侧来来自自不不同同亲亲本本DNA，，则则称称为为拼拼接接重重组组体体（（splicerecombinant）），，此此种种重重组组又又叫叫做做交互重组（reciprocalrecombination））。但如果切开的的链与原来断断裂的是同一一条链，重组组体含有一段段异源双链区区，其两侧来来自同一亲本本DNA，则则称为片段重组体（patchrecombinant）。连接分子可以以以两种交替替方式进行拆拆分，两侧基基因或是发生生交互重组，，或是无重组组发生。但无论哪种拆拆分方式都说说明一个原则则，即链交换换后总会在两两条DNA分分子上留下一一段异源双链链区，但侧翼翼序列的重组组未必与之同同时发生。不同生物体同同源重组的具具体过程虽有有不同，但基基本步骤大致致相同。两DNA分子只只要含有一段段碱基序列大大体类似的同同源区，就可可以发生重组组。二、细菌的基基因转移与重重组细菌可以通过过多种途径进进行细胞间基基因转移，并并通过基因重重组以适应随随时改变的环环境。细菌的的基因转移主主要有4种机机制：接合（（conjugation）、转化（transformation）、转导（transduction））、细胞融合（cellfusion）。1、细菌的接合作作用细菌的细胞相相互接触时遗遗传信息可由由一个细胞转转移到另一细细胞，称为接接合作用。供供体细胞为雄雄性，受体为为雌性。通过过接合而转移移DNA的能能力由接合质质粒提供，与与接合功能有有关的蛋白质质均由接合质质粒所编码。。能够促使染染色体基因转转移的接合质质粒称为致育育因子（fertilityfactor）），简称性因因子或F因子子。致育因子（F因子）通过过结合作用由由F+细胞向向F-细胞转转移，F质粒粒约1/3的的基因与转移移有关，traS和traT基因编编码表面排斥斥蛋白，阻止止F+细胞之之间的转移，，F+细胞的的性菌毛与F-细胞结合合后收缩，使使二者靠近，，TraD蛋蛋白构成转移移的通道，在在TraI在在TraY的的帮助下结合合到转移起点点oriT上上，切开一条条链，使其5΄端进入受体体细胞，并并合成其互互补链，使使F-细胞胞转化为F+细胞，，给体细胞胞中的单链链也可以合合成互补链链。在细菌基因因转移的不不同时间将将配对细胞胞分开，可可以确定基基因在染色色体上的位位置。F质质粒DNA可以通过过重组整合合到受体的的染色体中中，使受体体菌成为高高频重组（（Hrf)菌株，若若F质粒的的DNA未未能完整地地进入受体体菌，则受受体菌不能能转化为F+,F质粒粒的DNA可以被切切割出来，，有时可携携带宿主菌菌的染色体体DNA，，称作F΄因子，F΄因子携带的的基因可在在受体菌表表达。2、遗传转转化遗传转化（genetictransformation）是是指细菌品品系由于吸吸收了外源源DNA（（转化因子子）而发生生遗传性状状的改变现现象。具有摄取周周围环境中中游离DNA分子能能力的细菌菌细胞称为为感受态细胞胞（competentcell）。。自然条件下下感受态的的形成需要要10多种种蛋白质参参与，实验验室常用高高浓度的Ca2+处理使细菌菌形成感受受态。3、细菌的的转导转导（transduction）是是通过噬菌菌体将细菌菌基因从供供体转移到到受体细胞胞的过程。。4、细菌的的细胞融合合在有些细菌菌的种属中中可发生由由细胞质膜膜融合导致致的基因转转移和重组组。三、大肠杆菌重重组的分子子基础在细菌重组组反应中活活性最为明明显的是由由大肠杆菌菌染色体上上rec基基因和ruv基基因编码的的一些酶。。其中，主要要有RecA蛋蛋白，RecBCD酶，RuvABC酶等等到。1、RecA蛋蛋白RecA蛋白是催催化重组基基本反应的的酶。RecA有两两个主要的的功能：诱诱发SOS反应和促促进DNA单链的同同化（assimilation）。。单链同化是一个分子子的单链侵侵入到另一一个分子的的双螺旋上上，通过取取代双螺旋旋上的原始始链而形成成异源双链链。当RecA与DNA单链结合合时，数千千RecA单体协同同聚集在单单链上形成成螺旋状纤纤丝（helicalfilament）。。RecF、RecO和和RecR蛋白调调节RecA纤丝丝的装配和和拆卸。RecA催化的单单链同化RecA蛋蛋白分子质质量为38000da，它它与单链DNA结合合形成的螺螺旋纤丝每每圈含6个个单体，螺螺旋直径10nm，，碱基间距距0.5nm。此复复合物可以以与双链DNA作用用，部分解解旋以便阅阅读碱基序序列，迅速速扫掠寻找找与单链互互补的序列列。互补序序列一旦被被找到，双双链进一步步被解旋以以允许转换换碱基配对对，使单链链与双链中中的互补链链配对，同同源链被置置换出来RecA蛋蛋白引起DNA同源源重组的模模型2、RecBCD酶亦称核酸外外切酶V，，它通过chi序列列识别靶位位点，这种种酶的各个个亚基是由由recB，recC，，recD基因编编码的产物物。它是一一种有效降降解DNA的核酸酶酶，可以在在单链结合合蛋白的存存在下松开开DNA双双链，同时时还具有ATP酶活活性，它在在重组中的的作用是提提供具有3’-末端端的单链区区域。Chi位位点GCTGGTGG

CGACCACCsites3、RuvABCRuvA识别Holliday结结构连接点点。RuvB是一种种ATP酶酶，为分支支迁移提供供动力。RuvC是专一一识别Holliday结构构连接点的的核酸内切切酶，它在在体外切断断连接点以以拆分重组组中间体。。在大肠杆菌菌中由RuvA,RuvB和和RuvC蛋白参与与的同源重重组。（a）RuvA四四聚体的图图解。四个个亚基形成成的结构像像四个花瓣瓣的花。（b）RuvA/RuvB的作用：：（左）RuvA四聚聚体结合到到Holliday位点；（中）RuvB六聚聚体结合到到杂合双螺螺旋的两对对面，DNA穿过其其中心，RuvB六聚体的的作用像马马达，促进进超螺旋分分叉点通过过复合体移移动。（右）RuvC结合合到Holliday位点，，由其核酸酸酶活性切切断核酸链链，切割位位点由剪切切体辨认。。（c）RuvA四四聚体的电电荷分布，，蓝色表示示正电荷，，红色表示示负电荷，，注意正电电荷位于四四聚体的表表面，有四四个负电荷荷区域位于于其中心。。（d）假设的RuvA四聚聚体与Holliday位点点结合的结结构模型。。RecBCD和RecA的的共同作作用单链侵入Single-stranduptake链交换Single-strandassimilation重组修复复在复制叉叉处重组组水平的的ＤＮＡＡ修复第二节位位点特特异性重重组位点特异异性重组组（Site-specificrecombination））需要在特特定的位位点上发发生断裂裂和重接接，从而而产生精精确的ＤＤＮＡ重重排。位点特异异性重组组广泛存存在于各各类细胞胞中，起起着十分分特殊的的作用，，彼此有有很大的的不同。。它们的的作用包包括某些些基因表表达的调调节、发发育过程程中程序序性DNA重排排，以及及有些病病毒和质质粒DNA复制制循环过过程中发发生的整整合与切切除等。。此过程程往往发发生在一一个特定定的短（（20～～200bp））DNA序列内内（重组组位点）），并且且有特异异的酶（（重组酶酶）和辅辅助因子子对其识识别和作作用。位点特异异性重组组的结果果决定于于重组位位点的位位置和方方向。如如果重组组位点以以相反方方向存在在于同一一DNA分子上上，重组组结果发发生倒位位。重组组位点以以相同方方向存在在于同一一DNA分子上上，重组组发生切切除；在在不同分分子上，，重组发发生整合合一、λ噬菌体体DNA的整合合与切除除λ噬菌体体DNA进入宿宿主大肠肠杆菌细细胞后存存在溶原原和裂解解两条途途径，二二者的最最初过程程是相同同的，都都要求早早期基因因的表达达，为溶溶原和裂裂解途径径的歧化化做好准准备。两两种生活活周期的的选择取取决于CI和Cro蛋蛋白相互互拮抗的的结果。。CI蛋蛋白抑制制除自身身外所有有噬菌体体基因的的转录，，如果CI蛋白白占优势势，溶原原状态就就得到建建立和维维持。Cro蛋蛋白抑制制CI基因的转转录，它它占优势势噬菌体体即进入入繁殖周周期，并并导致宿宿主细胞胞裂解。。λ噬菌菌体的整整合发生生在噬菌菌体和宿宿主染色色体的特特定位点点，因此此是一种种特异位位点重组组。整合合的原噬噬菌体随随宿主染染色体一一起复制制并传递递给后代代。但在在紫外线线照射或或升温等等因素诱诱导下，，原噬菌菌体可被被切除下下来，进进入裂解解途径，，释放出出噬菌体体颗粒。。整合和切切除过程程是在细细菌DNA和噬噬菌体DNA专专一性的的附着位位点(attachmentsite,att)上上进行的的细菌的附附着点称称attB,由序列列BOB’组成成,噬菌菌体的附附着位点点称attP,由序序列POP’组组成。其中O序序列是attB和attP所共共有的，，所以称称为核心心序列（（coresequence)重组后形形成两个个新att位点点，attL(BOP’’)和和attR(POB’)位点专一一性重组组反应的的定向特特征取决决于重组组位点的的识别。。尽管整整合和切切除过程程是可逆逆的，但但反应导导向则由由不同条条件决定定的。整合过程程要求在在attB和和attP之间进进行识别别,而切切除过程程则在attL和和attR之间识识别1、整合合反应λ噬菌体体编码一一种酶——λ整合合酶（λintegrase,INT)，它能切断断ＤＮＡＡ，并能能使它重重新连接接．从而而直接将将噬菌体体ＤＮＡＡ插入大大肠杆菌菌染色体体中，通通过两条条ＤＮＡＡ的专一一位点上上的重组组合并成成一个环环状分子子．整合合作用需需要由大大肠杆菌菌编码的的整合宿宿主因子子ＩＨＦ（（integrationhostfactor））的共同作作用．模型说明明attP和和attB部位进进行了交交叉断裂裂，互补补单链末末端进行行交叉杂杂交。λλDNA交换换点之间间的距离离为7bp，在位点专专一性重重组中，，有关蛋蛋白质结结合在att部部位的特特定位点点上。当INT和IHF蛋白白结合在在attP位位点时形形成的复复合物称称为整合合体（intasome）。。整合体体就是捕捕获attB的中间间体。INT蛋蛋白分子子可能作作为整合合体的一一部分结结合到attB的的核心位位点上，，说明attP和attB的最最初识别别不是直直接取决决于DNA的同同源性，，而是由由INT蛋白识识别两个个att序列的的能力来来决定的的，当需需要链交交换反应应时，同同源序列列在此阶阶段才显显得重要要。2、切除除反应（（excision））当诱发原原噬菌体体生长时时，整合合作用发发生逆转转，这个个过程称称为切除除（excise）。切除需要要Xis蛋白，，它抑制制整合作作用。INT，，XIS，IHF连在在一起覆覆盖了全全部attP，从而而不利于于进行整整合反应应。当噬菌体体进入溶溶源状态态时优先先发生整整合反应应。而当当噬菌体体进入裂裂解周期期时则切切除反应应占优势势，通过过控制INT和和XIS的存量量发生适适当的反反应。二、细菌菌的特异异位点重重组鼠伤寒沙沙门氏杆杆菌（Salmonellatyphimurium）由鞭鞭毛蛋白白决定的的H抗原原有两种种，分别别为H1鞭毛蛋蛋白和H2鞭毛毛蛋白。。遗传分析析表明，，这种抗抗原相位位的改变变是由一一段995bp的DNA，称称为H片片段（Hsegment））发生倒倒位所决决定。hix基因编码码特异的的重组酶酶，即倒倒位酶（（invertase）Hin。该该酶为相相对分子子质量22000亚亚基的二二聚体，，分别结结合在两两个hix位点上，，并由反反向刺激激因子Fis（（factorforinversionstimulation））促使DNA弯弯曲而将将两个hix位点联结结在一起起，DNA片段段经断裂裂和再连连接而发发生倒位位。rH1表达产物物为H1阻遏蛋蛋白，当当H2基因表达达时，Hl基因因被阻遏遏；反之之，H2基因不表表达时，，H1基因才得得以表达达免疫球蛋蛋白基因因的重组组第三节Transposition(转座座作用））基因组可可通过获获得新序序列而进进化，也也可通过过现存序序列的重重排实现现这一目目的。无无论是原原核生物物还是真真核生物物，转座座子或转转座元件件（transposonortransposableelement)的移动提供了了基因组变化化的潜在可能能。一、转座子（（transposon，Tn）基因组上不必必借助同源序序列就可移动动的DNA片片段，它们可可以直接从基基因组内的一一个位点移到到另一个位点点。在原核生物和和真核生物中中都发现了经经由DNA移移动的转座子子。转座过程有以以下特征：①能从基因组组的一个位点点转移到另一一个位点，从从一个复制子子转移到另一一个复制子；；②不以独立的的形式存在（（如噬菌体或或质粒DNA），而是在在基因组内由由一个部位直直接转移到另另一部位；③转座子编码码其自身的转转座酶，每次次移动时携带带转座必需的的基因一起在在基因组内跃跃迁，所以转转座子又称跳跳跃基因；④转座的频率率很低，且插插入是随机的的，不依赖于于转座子（供供体）和靶位位点（受体））之间的任何何序列同源性性；⑤转座子可插插入到一个结结构基因或基基因调节序列列内，引起基基因表达内容容的改变，如如使该基因失失活，如果是是重要的基因因则可能导致致细胞死亡。。二、转座子的的类型和结构构特征所有的转座子子都有两个结结构特征：（1）两端有有20-40bp的反向向重复序列（（invertedrepetitivesequence,IR)（２）具有编编码转座酶（（transposase)的基因,这种种酶催化转座座子插入新的的位置。在原核生物中中已发现两种种类型的转座座子：（1）简单转转座子（simpletransposon）又称为插入序序列（insertionsequence，IS）。（2）复合转转座子（compositetransposon）（1）插入序序列（IS））插入序列是最最简单的转座座子，IS因因子是一种较较小的转座因因子，长度为为750～1550bp，只含有与与转座有关的的酶基因，不不含抗药性等等其他基因，，其两端都具具有15～25bp的反反向重复序列列（invertedrepeat，IR））。可以在不不同的复制子子间转移位置置，以非正常常重组的方式式从一个位点点插入到另一一个位点，从从而对该位点点的基因的结结构与表达产产生多种遗传传效应。每一一类型都以IS加鉴定类类型的编号来来表示。但后来的类型型编号只反映映它们的分离离历史，并不不表示至今所所分离的插入入序列的总数数IS因子本身身不具有表型型效应，只有有当它转座到到某一基因附附近或插入某某一基因内部部后，引起该该基因失活或或产生极性效效应时，才能能判断其存在在。所引起的的效应与其插插入的位置和和方向有关。。转座时，宿宿主靶部位双双链被交错切切开，经修复复后插入序列列两侧形成短短的正向重复复。靶序列通通常是任意的的，但交错切切开的长度是是固定的，一一般为5～9bp。（2）复合转转座子（Tn）一些转座子除除了除了有转转座酶基因外外，还携带药药物抗性(或或其他)标记记。这些转座座子以Tn和和数码来命名名。其中一类类是由携带药药物标记的中中央区域和两两侧的臂(arms)组组成的复合因因子(compositeelements)。有的转座子的的重复顺序就就是IS，复复合转座子也也和IS一样样，能从一个个位点转座到到另一个位点点。二、转座子的的转座机制转座的机制转座作用的机机制仍可分为为三种不同类类型：即复制型，非复复制型，保守守型其中复制型转转座需要两种种酶，转座酶和解解离酶复制转座作用用引起了转座座子的一个复复制，它插入入到一个接受受位点。捐赠赠位点保持不不变，以致捐捐赠者和接受受者都有转座座子的一个复复制非复制转座作作用允许一个个转座子像物物体一样从捐捐赠们点移动动到接受位点点，这样就在在捐赠位点留留下了一个断断裂。保守的转座作作用描述了另另一种非复制制结果，因子子在捐赠位点点被切除，然然后通过一连连串的反应插插入到一个靶靶位，这样每每一个核苷粘粘合都被保留留。复制转座作用用通过一个共共合体进行非复制转座作作用借助断裂裂和重聚进行行TnA转座作用：复复制型转座座需要转座酶酶和分解酶tnpA基因产物是一一个转座酶TnpR基因的产物具具有二重功能能，蛋白担任任着基因抑制制子表达和供供应分解酶的的功能。TnpR抑制了所有tnpA和自己的基因因的转录。共合体结构的的解离部位称称为res，即是是解离酶的结结合部位。位点I是遗传上作为为res部位的区域，，它的缺失将将使解离反应应完全不能进进行。然而解解离反应也与与部位II和III有关。因为其其中任何一个个部位缺失，，解离反应都都变得很弱。。三、转座子转座的的特征（1）转座不不依赖于靶序序列的同源性性（2）转座后后靶序列重复复（3）转座子子的插入具有有专一性（4）转座具具有排他性（5）转座具具有极性效应应（6）活化临临近的沉默基基因（7）区域性性优先转座频率的调调控对于细胞来说说，控制转座座子调换的频频率是很重要要的，转座子子必须能维持持某一最小的的移动频率，，因为太大的的频率会破坏坏宿主细胞，，研究表明每每一个转座子子都有控制它它自身调换频频率的机制。。通过反义RNA的翻译水水平控制IS10R外外侧边缘两个个启动子PIN弱启动子控制IS10R的转录POUT—强启动子右向转录宿主主DNAINRNA和OUTRNA有36bp的的重叠稳定性：OUTRNA››INRNA大量OUTRNA作为INRNA的的反义RNA四、转座子的的某些遗传学学效应1