木瓜中化学成分分析分离及抗氧化性研究

分类号……………ＵＤＣＪ７３６ｑｒ１２密级编号十Ｉ初大・挚ＣＥＮＴＲＡＬＳＯＵＴＨＵＮｌＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文论文题目．…．本瓜中．化学成分参鼬险离器撞氯…．－■●■－－●■－●●●●●…－……●…●●■●■●●－－●－－●＿●－－＿－－…●…●●●－－…●●●－●●●●●●●●●●●－●●●●■…●■化性研究学科、专业：…分析绳学…研究生姓名：…一朱．学娟…导师姓名及专业技术职务……………羲新烹…．封熬撬…………。原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：墨蠲日期：ｊ出生年互月塑学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。储签名枫导师签名蝉吼丝年』月笪日硕士学位论文摘要摘要本文研究了中药木瓜中黄酮类化合物的提取、纯化与测定方法，并对木瓜中黄酮及芦丁清除１，１．二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ）的能力进行了初步探讨，最后采用ＩＣＰ．ＭＳ同时测定了木瓜中的２６种微量元素。（１）总黄酮的提取：以总黄酮的得率为检测指标，分别采用了超声提取法和微波提取法进行提取。通过单因素实验以及正交实验，确定了两种提取方法的最佳提取工艺，超声提取法效果较好，总黄酮得率达１０．５４％。（２）总黄酮的纯化：比较了五种大孔树脂的吸附、解吸性能，选择Ｓ．８型大孔树脂纯化水木瓜总黄酮，采用浓度为１．５０ｍｇ／ｍＬ木瓜提取液以１ＢＶ／ｈ流速上柱，６０％乙醇１ＢＶ／ｈ流速进行洗脱，所得总黄酮粗品纯度达８８．２３％。（３）芦丁的测定及分离：采用聚酰胺柱层析和高速逆流色谱（ＨＳＣＣＣ）两种方法对木瓜中芦丁进行分离纯化。确定了最佳分离条件，其中高速逆流色谱法效果较好，芦丁的纯度可达９７％。（４）总黄酮和芦丁的测定：总黄酮的测定，采用用分光光度法，以芦丁为对照品，芦丁浓度Ｃ（ｇｇ／ｍＬ）与吸光度Ａ的回归方程：Ａ＝Ｏ．００９６Ｃ＋０．００９４（Ｒ＝０．９９９１），芦丁浓度在８～６４９９／ｍＬ的范围内线性关系良好，加标回收率为９６．３‰１０３．８％。芦丁的测定，采用高效液相色谱法，色谱条件为：ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣ１８柱（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ；５９ｍ），所用流动相为流动相为乙腈．Ｏ．３％醋酸，检测波长３６０ｎｍ，流速为０．８ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２５℃，得芦丁浓度Ｃ与峰面积Ｙ的回归方程：Ｙ＝７．７ｘ１０２＋７．０ｘ１０３ｘＣｆｒ＝０．９９９５），线性范围２５～１２５Ｉｔｇ／ｍＬ。（５）木瓜提取物和芦丁抗氧化性实验：不同溶剂提取物均具有一定程度清除ＤＰＰＨ自由基的能力，但清除能力差异较大，其强弱顺序为甲醇＞乙醇＞乙酸乙酯＞水＞氯仿；并证实了芦丁具有一定的抗氧化能力。（６）微量元素含量的测定：建立电感耦合等离子体原子质谱法（ＩＣＰ．ＭＳ）Ｎ时测定了木瓜中２６种元素含量的方法。对所测定元素的相对标准偏差（ＲＳＤ）均小于２％，回收率在９６．５％～１０５．６％之间，结果可信度高。硕士学位论文摘要木瓜黄酮，ＨＳＣＣＣ，芦丁，ＩＣＰ．ＭＳ，微量元素ＩＩ硕士学位论文ＡＢＳＴＲＡＣＴＡＢＳＴＲＡＣＴＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｉｎＰａｗｐａｗｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓａｎｄｒｕｔｉｎｗｅｒｅａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｐｒｉｍａｒｉｌｙ；ｔｈｅｎ２６ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｄｉｒｅｃｔｌｙｂｙＩＣＰ．ＭＳ．（１）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓ．Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ．ａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ．Ａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ．ａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ，ｗｉｔｈｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｌＯ．５４％．（２）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓ．Ｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ．ＴｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｉｎＰａｗｐａｗｗｅｒｅａｂｓｏｒｂｅｄａｎｄｄｅｓｏｒｐｅｄｗｅｌｌｂｙＳ－８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１．５０ｍｇ／ｍＬｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈｔｈｅｒａｔｅｏｆ１ＢＶ／Ｉｌｕｐｔｏｒｅｓｉｎｂｅｉｎｇｓａｔｕｒａｔｅｄａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ．Ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｗａｓｅｌｕｔｅｄｂｙ６０％（ｖ／ｖ）ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈｔｈｅｒａｔｅｏｆ１ＢＶ／ｈ．Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｗａｓ８８．２３％．（３）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｒｕｔｉｎ．Ｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅｐｏｌｙａｍｉｄｅｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｎｄＨｉｇｈ—ＳｐｅｅｄＣｏｕｎｔｅｒ－ＣｕｒｒｅｎｔＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＳＣＣＣ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｅｐａｒａｔｅｒｕｔｉｎｉｎＰａｗｐａｗ．Ａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｈｉｇｈ—ＳｐｅｅｄＣｏｕｎｔｅｒ－ＣｕｒｒｅｎｔＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｗａｓｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｗｉｔｈｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｒｕｔｉｎｗａｓ９７％．（４）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓａｎｄｒｕｔｉｎ．ＴｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｉｎＰａｗｐａｗｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙｗｉｔｈｒｕｔｉｎａｓｓｔａｎｄａｒｄｃｏｎｔｒ０１．ＴｈｅｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｗａｓＡ＝０．００９６Ｃ＋０．００９４（ＩＰ０．９９９１），ｗｉｔｈａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ８－６４９９／ｍＬ．Ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｒｕｔｉｎ，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅａｃｈｉｅｖｅｄｏｎａＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣｌｓｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｉｎｘ４．６ｒｎｍ，５ｐｍ）ｗｉｔｈｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｏｆＣＨ３ＣＮ—Ｈ２０一ＣＨ３ＣＯＯＨ，ｄｅｔｅｃｔｅｄａｔ３６０ｎｍ．Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ０．８ｍＬ／ｍｉｎ．ＴｈｅｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｗａｓＹ＿７．７×１０ｚ＋７．Ｏ×１Ｏｊ×Ｃ（ｒ－－Ｏ．９９９９５），ｗｉｔｈａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ２５－－。１２５９９／ｍＬ．（５）Ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｒｕｔｉｎａｎｄｆｌａｖｏｎｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍ硕士学位论文Ｐａｗｐａｗ，ｔｈｅＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔ，ｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｐａｗｐａｗｅｘｔｒａｃｔｓｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ａｎｄｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｘｔｒａｃｔｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｌｖｅｎｔｓｗａｓｉｎｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｍｅｔｈａｎ０１ｅｘｔｒａｃｔ＞ｅｔｈａｎｏｌｅｘｔｒａｃｔ＞ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅｅｘｔｒａｃｔ＞ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔ＞ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔ．Ａｎｄｒｕｔｉｎａｌｓｏｈａｄａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙ．（６）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓ．ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａＩＣＰ—ＭＳｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＰａｗｐａｗ．２６ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＣＰ．ＭＳ．Ｒｅｓｕｌｔｗａｓｔｈａｔｆｏｒａｎｏｆｔｈｅａｎａｌｙｚｅｄｅｌｅｍｅｎｔｓ．ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ＲＳＤ）ｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２％ａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ９６．５％～１０５．６％．ＫＥＹＷＯＲＤＳＰａｗｐａｗｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ＨＳＣＣＣ，ｒｕｔｉｎ，ＩＣＰ—ＭＳ，ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓ硕士学位论文目录目录摘要………………ＩＡＢＳ７ｒＲＡＣＴ…………………．ＩＩＩ第一章绪论…………．１１．１前言………………．．１１．２木瓜的生物学性状……………．１１．３木瓜的化学成分………………．１１．３．１糖类………………．２１．３．２萜类………………．．２１．３．３挥发油………………………２１．３．４氨基酸及蛋白酶类…………２１．３．５有机酸类……………………３１．３．６无机成分…………………．．３１．３．７其它………………一３１．４木瓜的药理作用………………一４１．４．１镇痛作用……………………４１．４．２抑瘤作用……………………４１．４．３保肝作用………………一４１．４．４其他………………．．５１．５天然产物中黄酮类化合物研究进展…………．５１．５．１天然产物中黄酮类化合物的提取………一６１．５．２天然产物中黄酮类化合物的分离纯化……８１．５．３黄酮类化合物分析…………１１１．６黄酮类化合物生物活性………１２１．６．１黄酮类化合物的生物活性…………………１２１．６．２黄酮类化合物的应用……………………．．１４１．７本课题研究目的和意义………１４第二章木瓜中总黄酮的提取及测定………………１５２．１超声提取………………………．．１５２．１．１实验部分……………………１５２．１．２结果与讨论………………１６２．２微波提取………………………．２０２．２．１实验部分……………………２０Ｖ硕士学位论文目录２．２．２结果与讨论………………．２０２．３．木瓜中黄酮的定性定量分析…………………２２２．３．１实验部分…………………．．２３２．３．２结果与讨论………………．．２４２．４小结……………………。２６第三章木瓜中黄酮的纯化及芦丁的分析分离……２８３．１木瓜中黄酮的大孔吸附树脂纯化……………２８３．１．１实验部分……………………２８３．１．２结果与讨论…………………．３０３．２木瓜中芦丁的ＨＰＬＣ分析……………………３．２．１实验部分…………………．３．２．２结果与讨论………………一３．３木瓜中芦丁的ＨＳＣＣＣ分离…………………３．３．１实验部分…………………．３．３．２结果与讨论………………３．４木瓜中芦丁的聚酰胺柱分离…………………３．４．１实验部分…………………３．４．２结果与讨论………………３．５小结……………………．第四章木瓜提取物及芦丁的抗氧化性研究………４．１黄酮类化合物清除自由基测定原理…………４．２实验部分…………４．２．１仪器与试剂………………．４．２．２样品制备……………………．４．２．３测定………………４．３结果与讨论……………………．４．３．１测定波长的选择…………．．４．３．２ＤＰＰＨ工作曲线的绘制…………………．．４．３．３芦丁清除ＤＰＰＨ自由基能力……………．４．３．４木瓜提取物清除ＤＰＰＨ自由基能力……一４．４／Ｊ、结……………………．．第五章木瓜中微量元素含量分析…………………５．１实验部分………………………５．１．１仪器与试剂………………．硕士学位论文目录５．１．２木瓜样品制备及处理……………………．．５０５．１．３仪器工作条件………………５１５．２结果与讨论……………………．．５ｌ５．２．１酸度的影响………………５１５．２．２精密度实验………………．５１５．２．３回收率实验………………．５１５．３小结……………………．．５４结论……………………………５５参考文献……………。５６攻读学位期间主要的研究成果……………………．６５硕士学位论文第一章绪论１．１前言第一章绪论木瓜（ＦｒｕｃｔｕｓＣｈａｅｎｏｍｅｌｉｓ）主产于安徽、山东、湖北、贵州、西藏等地。据“本草纲目”记载，木瓜具有舒筋络，和脾胃，益筋血的药理作用。特别是治疗腰膝疼痛，脚气水肿功效显著，具平肝舒筋、和脾化湿的功效，用于湿痹拘挛、腰膝关节酸肿疼痛、吐泻转筋。《中华人民共和国药典》（２００５版）收载中药木瓜为蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）木瓜属（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ）落叶灌木植物贴梗海棠Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｐｅｃｉｏｓａ（Ｓｗｅｅｔ）Ｎａｋａｉ的干燥成熟果实，但木瓜属的毛叶木瓜、西藏木瓜、光皮木瓜、日本木瓜等亦被入药【ｌ】。木瓜的营养价值与弥猴桃媲美，以“百益之果＂著称，是卫生部２００３年公布的３０个药食兼用食品之一。近年来，利用木瓜果实加工罐头、果脯、果酱、果酒、果汁等保健食品更是方兴未艾，但是对木瓜果实中的营养保健成分尚缺系统研究，为更好开发利用这一资源，有必要对它进一步进行研究和开发利用【２】。１．２木瓜的生物学性状木瓜（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）别名木梨、光皮木瓜。属蔷薇科，木瓜属。落叶灌木或小乔木，高可达７米，无枝刺；小枝圆柱形，紫红色，幼时被淡黄色绒毛；树皮片状脱落，落后痕迹显著。叶片椭圆形或椭圆状长圆形，长５－９厘米，宽３－６厘米，先端急尖，基部楔形或近圆形，边缘具刺芒状细锯齿，齿端具腺体，表面无毛，幼时沿叶脉被稀疏柔毛，背面幼时密被黄白色绒毛；叶柄粗壮，长１．１．５厘米，被黄白色绒毛，上面两侧具棒状腺体；托叶膜质，椭圆状披针形，长７．１５毫米，先端渐尖，边缘具腺齿，沿叶脉被柔毛。花单生于短枝端，直径２．５．３厘米；花梗粗短，长５．１０毫米，无毛；萼筒外面无毛：萼裂片三角状披针形，长约７毫米，先端长渐尖，边缘具稀疏腺齿，外面无毛或被稀疏柔毛，内面密被浅褐色绒毛，较萼筒长，果时反折：花瓣倒卵形，淡红色；雄蕊长约５毫米；花柱长约６毫米，被柔毛。梨果长椭圆体形，长１０．１５厘米，深黄色，具光泽，果肉木质，味微酸、涩，有芳香，具短果梗。花期４月，果期９．１０月【３１。１．３木瓜的化学成分自上世纪５０年代，各国学者对木瓜化学成分做了一定的研究，确定了其中主硕士学位论文第一章绪论要含有黄酮类（Ｆｌａｖｏｎｉｏｄｓ）、萜类（Ｔｅｒｐｅｎｅｓ）、挥发油（Ｖｏｌａｔｉｌｅｏｉｌ）、有机酸类（Ｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄ）、氨基酸及蛋白酶类（ＡｍｉｎｏａｎｄＰｒｏｔｅａｓｅ）和无机成分（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）等化学成分，其中黄酮类和有机酸类化合物具有很好的抗肿瘤作用。１．３．１糖类秦岩等【４】用石油醚等有机溶剂从木瓜中提取多糖，然后采用苯酚一硫酸光度法测定其含量，得出其平均含糖量为１０．４９％。杨光等‘５１采用改进后的裴林氏液容量滴定法测定木瓜中总糖的动态变化，木瓜总糖在每年３月中下旬开始迅速增加，到４月下旬达到最大值，以后呈缓慢下降的趋势。Ｗａｎｇ，ＳＭ等【６】也做过木瓜总糖的研究工作。１．３．２萜类早在１９８３年，罗景方【．７】就从木瓜中分离到五环三萜类化合物，并鉴定为齐墩果酸（Ｏｌｅａｎｏｌｉｅａｅｉｍ。郭学敏等【８】采用８０％乙醇冷浸然后减压浓缩，硅胶柱层析或薄层层析分离，从木瓜中分离出了３个五环三萜类化合物，经过波谱分析与文献对照确定其结构分别为：乙酰熊果酸（３．Ｏ．ａｃｅｔｙｌｕｒｓｏｌｉｃａｃｉｄ）、３．Ｏ．乙酰坡模醇酸（３－０．ａｃｅｔｙｌｐｏｍｏｌｉｅａｄｍ、桦木酸（Ｂｅｔｕｌｉｎｉｃａｃｉｄ）。陈洪超等【９】用９５％乙醇室温浸提，石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，反复正反相硅胶柱色谱分离，首次从木瓜中分离出乌苏酸（Ｕｒｓｏｌｉｃａｃｉｄ）。１．３．３挥发油史亚歌等【１０】采用水蒸气蒸馏法提取光皮木瓜中的挥发油成分，经过ＧＣ．ＭＳ分离与分析，共分离出了７６个组分，鉴定出其中的４６种化合物，占挥发油总量的７０．１７％，其主要成分有４．甲基．５．（１，３．二戊烯基）．二氢呋喃．２．酮、４一（３一羟基．３．甲基．１．丁炔）一苯甲酸甲酯、Ｙ．癸内酯、正己醇、Ｑ．杜松醇、顺．１１．十六烯酸、辛酸己酯等，涉及内酯类、酯类、酸类、醇类、酚醚类等化合物，还有少量烃、醛、酮、杂环以及含氮化合物。内酯及酯类共计２０个组分，含量合计４０％以上，为光皮木瓜挥发油主要组成部分。１．３．４氨基酸及蛋白酶类硕士学位论文第一章绪论Ｗａｎｇ，ＳＭ等【６】采用氨基酸自动分析仪分析测定了木瓜中氨基酸的种类和含量，发现木瓜中含１６种氨基酸，其中具有除蛋氨酸外的人体内必须的７种氨基酸，且含量丰富，达４１％以上，其中天门冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸的含量很高。陈洪超等【ｌｌ】则在木瓜中检测到了１９中氨基酸，并且还比较了木瓜、毛叶木瓜、西藏木瓜、皱皮木瓜中蛋白质的含量。结果为：每１００ｇ皱皮木瓜中蛋白质的含量最高，为６．１６ｇ，而其余３种均为３￣４ｇ。木瓜蛋白酶是经木瓜乳汁干燥而得的，至少含有４种主要酶类，即木瓜蛋白酶［ＥＣ３．４．２２．２］（ｐａｐａｉｎ）、木瓜凝乳蛋白酶［ＥＣ３．４．２２．６】（ｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎ）、木瓜蛋白酶［ＥＣ３．４．２２．３０］（ｐａｐａｙａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，也称ｐａｐａｙａｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ、ｐａｐａｙａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＨＩ、ｃａｒｉｃａｉｎ）、木瓜凝乳蛋白酶Ｍ［ＥＣ３．４．２２．２５］（ｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎＭ，也称ｇｌｙｅｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ｐａｐａｙａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＩＶ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＧｌｙ－Ｃ）［１２１。１．３．５有机酸类高诚伟等【”】采用乙醇提取果肉中的有机酸及其衍生物，经酸碱处理、溶剂萃取、甲酯化等前处理，采用ＧＣ—ＭＳ分离分析，共鉴定了１６种有机酸，主要含有脂肪酸、二元酸和芳香酸，还有不常见的Ｃ９的烷、烯、炔酸，含量都很高，其中柠苹酸含量高达２０．７４％。洪永福等【１４】比较分析了安徽的宣木瓜、河南的皱皮木瓜和光皮木瓜的乙醚提取物。宣城产的木瓜和河南的皱皮木瓜中有机酸成分有１０个，分别占５１．７２％和２６．４８％，而河南光皮木瓜仅含有７个，占４４．７６％。１．３．６无机成分吴延俊等【１５】采用了原子吸收分光光度法和极谱法等测定了宣木瓜、川木瓜、皱皮木瓜和藏木瓜中微量元素的含量，且４种木瓜中都含有人体所必须的微量元素，有铜、锰、铁、锌、镉、镍、钻、铬、砷，而只有宣木瓜中不含镉。Ｗａｎｇ，ＳＷ掣６】采用原子吸收分光光度法测定了遵义野木瓜和山东产木瓜“长俊＂、“一品香＂中微量元素的含量，这３种木瓜中均含有丰富的钙、钠、钻、磷，“一品香”还含有硒。不同种和同种不同产地的木瓜所含微量元素的种类与含量略有不同，但各种木瓜中都含有丰富的钙、铁、镁。１．３．７其它Ｗａｎｇ，ＳＭ等【６】还测定了木瓜中维生素的含量，其中含量最高的为维生素Ｃ，３硕士学位论文第一章绪论高于一般栽培水果的３～３１倍，并且还有丰富的维生素Ｂｌ、Ｂ２和ｐ．胡萝卜素。陈洪超掣９１首次从木瓜中分离得到了桔儿茶素、莽草酸、奎尼酸，还从木瓜中分离得到了二十九烷．１０．醇（Ｉ）、ｐ．谷甾醇（ＩＩ）、１３．胡萝卜苷（Ⅵ）等。此外，木瓜中还含有木瓜总皂苷，具有镇痛作用［１６－１８】。１．４木瓜的药理作用１．４．１镇痛作用汪氏掣１９】首次从宣木瓜中提取出了木瓜总苷，通过乙酸扭体等反应得出不同剂量的木瓜苷可以抑Ｎｄ，鼠的乙酸扭体反应和甲醛第二相反应；木瓜苷可以使佐剂性关节炎大鼠致炎第２８关节滑膜细胞升高的ＰＧＥ２和ＴＮＦ．ｃｃ水平明显降低。木瓜苷镇痛作用机制可能和其抑制外周炎症介质有关。同时它还对胶原性关节炎，角叉菜胶、蛋白所导致的足肿胀都有明显的抑制作用，能明显对抗醋酸刺激所引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增高，抑制大鼠棉球肉芽肿的形成【２０－２１１。１．４．２抑瘤作用木瓜提取液２ｍｇ／ｋｇ对体外培养的正常人胚胎二倍体成纤维细胞（２ｒ）ｓ细胞）第３５代有明显的减缓生长作用瞄】。木瓜中含有许多种抗肿瘤的化学成分，实验证明，齐墩果酸、熊果酸、桦木酸、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶都有很好的抑制肿瘤的效果。Ｔｏｋｕｄａ等［２３】通过给小鼠服用齐墩果酸和熊果酸，证实它们对１２．Ｏ．十四．烷酰佛波醇．１３．乙酯（ＴＰＡ）引起的乳头状瘤有明显的抑制作用，从而延缓小鼠乳头状瘤的发生，降低发病率。张氏等【２３】进行了熊果酸体外抗胃癌细胞ＳＧＣ７９０１机制的研究，发现熊果酸对ＳＧＣ７９０１细胞具有很好的抗肿瘤活性，推测其机制可能与细胞毒作用、增殖抑制作用及下调调亡相关蛋Ｉ兰ｉＢｃｌ．２表达而促进调亡有关。叶氏等【２４】采用桦木酸和其衍生物２３．羟基桦木酸等来抑制人的黑色素瘤细胞Ａ３７５、小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６生长，取得明显的效果。蔡氏等【２５之６】利用分离纯化的木瓜凝乳蛋白酶对鼠肝癌细ｈｅｐａ－６和人肝癌细胞７４０２进行体外杀伤实验，证明木瓜凝乳蛋白酶对ｈｅｐａ．６细胞和人肝癌７４０２细胞具有显著的抑制作用。１．４．３保肝作用郑智敏等【２７１利用木瓜混悬液６ｍＬ／ｄ对四氯化碳引起的大白鼠急性肝损伤病４硕士学位论文第一章绪论理模型进行灌胃处理，即木瓜每日用药剂量为３ｇ／ｋｇ，共１０ｄ。经病理检查木瓜有减轻肝细胞坏死，减轻肝细胞脂变，防止肝细胞肿胀、气球样变，促进肝细胞修复作用，还有显著的降低血清丙氨酸转移酶作用。木瓜中含有保肝化学成分齐墩果酸和熊果酸。齐墩果酸对四氯化碳造成的肝损伤具有保护作用，能减少肝实质细胞的坏死，脂肪变性和退化，并在临床上可用于肝炎的治疗【２引。ＳａｒａｓｗａｔＢ等矧研究证明，乌苏酸对硫代乙酰胺、半乳糖胺、四氯化碳造成的大鼠肝损伤有剂量依赖性的保护作用（剂量５￣２０ｍ班ｇ，肝保护作用２１％１００％）。１．４．４其他药理研究表明，木瓜具有很好的抗菌抗炎作用。吴虹等【３０】采用二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加模型，比较研究了木瓜总提物、木瓜苷和非木瓜苷的抗炎镇痛作用，结果表明木瓜苷的抗炎作用最明显，木瓜总提物也有显著的效果，而非木瓜苷则无此作用。木瓜汁和木瓜煎剂对肠道菌和葡萄球菌有很好的抑制作用【３１１。杨兴梅等【３２】证明资木瓜提取物具有降低胃肠道平滑肌张力、抑制肠蠕的作用，并能抑制乙酰胆碱引起的消化道的张力升高，其主要作用机制可能和抗钙作用有关。木瓜粉中能够检出很多具有抗氧化活性的物质，如具有抗氧化活性的氨基酸、ＳＯＤ、过氧化氢酶、过氧化物酶等，具有清除自由基、抗脂质过氧化作用【３３埘】。黄国伟等【３５】采用无血清体外细胞培养方法培养出了鼠胚大脑神经细胞，通过添加木瓜粉和不添加组所含酶类对比以及透射电镜观察，发现木瓜粉可以促进缺氧损伤大脑神经细胞的形态学恢复。１．５天然产物中黄酮类化合物研究进展黄酮类（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）化合物广泛存在于植物中，是植物长期自然选择过程中产生的次级代谢产物。黄酮类化合物因为具有多种生物活性，近年来受到很大的关注，发展也很快，目前已知的黄酮类化合物种类已达了４０００种以上，它们多数以甙的形式存在，少数以游离形式存在。黄酮类化合物的基本母核早期指２．苯基色原酮，近年来则是泛指两个具有酚羟基的苯环（Ａ．与Ｂ．环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物【３¨引。其基本母核的结构式如图１．２所示。５硕士学位论文第一章绪论色原酮ｏＯ２．苯基色原酮Ｃ６Ｃ３Ｃ６图１－２黄酮类化合物的母核结构１．５．１天然产物中黄酮类化合物的提取由于黄酮类化合物具有丰富多样的的药理作用，所以研究者们尝试着从不同的植物中提取黄酮类化合物，该类化合物的提取方法有许多，常见的提取方法有如下几种。１．５．１．１热水提取法热水提取法提取黄酮类化合物多数用于提取黄酮甙、二氢黄酮和二氢黄酮醇。由于二氢黄酮及二氢黄酮醇等为非平面分子结构，分子间排列不紧密，引力较小，有利于水分子进入，因而可以很好地溶于水。在提取过程中要考虑用水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素。热水提取法具有提取路线简单容易掌握，对提取设备要求较低，投入资金少的特点。由于没有使用酸，碱，有机溶剂等具有腐蚀性、易燃易爆溶剂，因而安全性较好，环境污染小。王威等【３９】曾利用了热水提取法，乙醇溶剂提取法，酸沉淀这三种方法提取了山楂叶中的黄酮物质，通过综合衡量提取物得率和总黄酮化合物的含量等指标，得出热水提取法是这三种方法中最好的提取法。１．５．１．２碱性水或碱性稀醇提取法由于黄酮类成分多含有酚羟基，所以显酸性，可溶于碱性溶液中，因此可利用碱性水（如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液）或碱性稀醇（如５０％乙醇）浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。丁利君等【删从菊花中提取黄酮类物质时，发现用ｐＨ值为１０的氢氧化钠溶液浸出效果较好。曹永刚【４１】从槐米中提取芦丁，则选用了碱性较强的饱和石灰水作溶剂，这样则有利于芦丁成盐溶解析出。１．５．１．３有机溶剂提取法６硕士学位论文第一章绪论常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等，但由于甲醇、氯仿、丙酮等的毒性较大，因此一般采用乙醇为提取溶剂。本法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类化合物，对设备要求简单，产品得率高，但成本较高，杂质含量也较高。常见的可以分为三种方法：冷、温浸法、渗漉法和回流法。根据不同原料特点选用不同的方法。例如：元宝枫叶粉中提取黄酮类物质采用的是冷浸法，用７０％乙醇提取，提取率和黄酮含量都很高，提取物较易浓缩和干燥【４２１；陈皮苷提取利用了乙醇渗漉法，使用５０％或６０％的乙醇，１６倍提取物时提取的效果最佳【４习；从水飞蓟中提取水蓟宾，则用了乙酸乙酯做为溶剂，用索氏提取法连续回流抽提９次，然后在甲醇中经多次重结晶可得水蓟宾纯品畔】。１．５．１．４超声提取法超声波是频率大于２０ｋＨｚ的声波，具有波动和能量的双重属性。超声波振动的空化、机械粉碎、搅拌等作用，有利于溶剂渗入生物细胞，加速天然原料中的有效成分进入溶剂，从而提高有效成分的提取率１４５１。张喜梅【蛔、郑春英【４７】等分别研究了葛根和五味子叶中总黄酮的超声提取工艺，考察了料液比、提取时间、温度及乙醇溶剂的浓度对总黄酮得率的影响，确定了最佳提取工艺；曹雁平【４８１等利用单频超声、双频复合和双频交变三种不同超声方法对姜黄色素和姜黄总黄酮提取，发现双频复合超声提取效果较好。１．５．１．５微波提取法微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，能使目标组分直接从基体分离，因而具有较好的选择性。另外，微波法还具有热效率高、升温快速均匀、萃取效率高、大大缩短提取时间等优点。李嵘等【４９】对微波提取银杏叶黄酮苷进行了研究，以水为溶剂对银杏叶进行了微波处理，提高了银杏叶黄酮的提取率，并缩短了提取时间。此方法是将传统水提法与高效微波法相结合，即降低了成本，又提高了效率，是一种有发展前景的新工艺。１．５．１．６酶解法由于黄酮类化合物大多包含在细胞内，可用酶将细胞壁或细胞膜破坏使其释放出来，再进行进一步的提取分离。此法较其他方法较为温和，提取率相对较高，成本较低。王晓等【５０例用纤维素酶和果胶酶的复合酶液对山楂叶进行酶解，然后用水提取，结果与传统工艺相比，提取率提高了１６．９％，效果显著。用酶法处理原料时，应注意选择合适的酶，同时也要注意选用合适的酶浓度，酶解温度，酶７硕士学位论文第一章绪论解时间和溶液的酸度。１．５．１．７超临界流体萃取法近十年来，随着超临界流体提取（ＳＦＥ）技术的迅速发展，在天然药用植物有效成分提取中应用也越来越广泛。和上述提取工艺相比，它具有提取效率高、无溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点。同时还能够通过控制临界温度和压力的变化，来达到选择性提取和分离纯化的目的【５１】。但是由于超临界提取所需的设备价格昂贵和生产成本高，且提取物中烷基酚含量较高，目前仍不能进行规模化生产。总之，黄酮类化合物提取的方法有很多，每种方法都有其各自的优缺点，要根据提取物的性质，提取成本及工艺设备等条件来选择适合的提取条件，提高黄酮类物质的提取率，增大原料的利用效果。１．５．２天然产物中黄酮类化合物的分离纯化１．５．２．１有机溶剂萃取此法是初步分离方法，主要将苷元、苷进行分离。常用的操作是乙醇提取物中加适量的水后，依次采用石油醚、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，石油醚中可能没有黄酮或仅有多甲氧基黄酮，乙醚中为部分游离黄酮，乙酸乙酯中可能含有多羟基黄酮和黄酮单糖苷，正丁醇中有二个糖以上的黄酮苷。１．５．２．２铅盐沉淀法在黄酮类成分的混合物中，具有邻二酚羟基成分和没有此结构的成分，可采用铅盐法分离。有Ｃｇ－酚羟基的成分可被醋酸铅沉淀，不具有邻二酚羟基的成分可被碱式醋酸铅沉淀，达到分离的目的。黄酮类化合物与铅盐反应生成的沉淀，过滤后悬浮在乙醇中，通入Ｈ２Ｓ进行复分解，滤除硫化铅沉淀，滤液中可得到含有黄酮类的化合物。但初生态的ＰｂＳ沉淀具有较强的吸附性，因此现多不利用Ｈ２Ｓ脱铅，而是采用硫酸盐或磷酸盐，或用阳离子交换树脂脱铅。１．５．２．３ｐＨ梯度萃取法梯度ｐＨ萃取法适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。根据黄酮苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次采用５％ＮａＨＣ０３、５％Ｎａ２Ｃ０３、０．２％ＮａＯＨ、４％ＮａＯＨ溶液萃取，８硕士学位论文第一章绪论来达到分离的效果。一般规律是具有７，４’一二羟基者可溶于ＮａＨＣ０３溶液，具有７或４’一羟基者可溶于Ｎａ２Ｃ０３溶液，具有一般酚羟基者可溶于０．２％ＮａＯＨ溶液，具有５．羟基者只能溶于４％ＮａＯＨ溶液。１．５．２．４大孔树脂吸附法大孔树脂是近１０年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，众多试验研究表明［５２－５４１大孔树脂吸附法具有物化稳定性高、吸附选择性好、再生简便、解吸条件温和、使用周期长等优点。汤建萍等【５５】比较了Ｄ１０１、Ｄ３５２０、ＮＫＡＩＩ、ＡＢ．８、Ｘ．５、ＨＰＤ．１００、ＨＰＤ．３００、ＨＰＤ．６００等８种大孔吸附树脂对荔枝核中黄酮类化合物的吸附和解吸性能，筛选出效果较好的ＨＰＤ．３００树脂进行分离纯化实验研究。实验结果表明，ＨＰＤ．３００树脂能够很好地吸附和解吸荔枝核的黄酮类化合物，并确定了最佳的吸附和解吸工艺条件。采用最佳的工艺参数分离纯化荔枝核黄酮类化合物，黄酮类化合物的含量由３１％提高到了８２％。朱宏剩５６】等采用ｘ．５大孔吸附树脂与聚酰胺树脂对竹叶总黄酮进行了精制，最终产物竹叶总黄酮含量可达７８．９７％，显著的提高了竹叶总黄酮提取物的纯度。１．５．２．５柱层析法柱层析法是分离黄酮类物质的一种有效技术，该法操作简便，回收率高，产品纯度高。但一次性处理量较小，成本相对较高。常用的吸附剂有硅胶、聚酸胺、氧化铝和硅藻土等。柱色谱用硅胶是一种高活性吸附材料，属非晶态物质，其化学分子式为ｍＳｉ０２．ｎＨ２０。不溶于水和任何溶剂，无毒无味，化学性质稳定，除强碱、氢氟酸外不与任何物质发生反应。各种型号的硅胶因为制造方法的不同而拥有不同的微孔结构。在用硅胶为填料的色谱柱上，样品和洗脱剂与硅胶之间主要靠吸附．洗脱达到分离，影响黄酮类化合物分离的主要因素有：①与硅胶之间具有氢键作用力；②与洗脱溶剂之间的作用力【，丌。因此选择适合的溶剂成为能否很好分离的关键因素，溶剂的洗脱能力对于不同的吸附剂来说是不同的，在选择溶剂时，要综合考虑溶剂的强度、粘度、沸点和毒性等。一种溶剂往往难以分离多流份的混合物，因此可以采用混合溶剂以达到一定的溶剂强度。极性较大的多羟基黄酮类化合物，则要选择溶剂强度较大的洗脱溶剂。聚酰胺柱色谱。对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。它吸附强度主要在于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合９硕士学位论文第一章绪论物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律：①苷元相同，洗脱先后顺序一般是：三糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。②苷元母核上增加羟基，洗脱速度相应减慢。③不同类型黄酮类化合物，洗脱先后顺序一般是：异黄酮、二氢黄酮、黄酮、黄酮醇。④分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，因而查耳酮比相应的二氢黄酮难洗脱。聚酰胺对各种黄酮类化合物（包括苷及苷元）有较好的分离效果，且分离量比较大，适合于制备性分离。白云娥等【５８】比较了３种粒径范围的聚酰胺对金莲花总黄酮的吸附与解吸，并考察了上样药液ｐＨ值、上样浓度、最大吸附容量、洗脱溶剂的选择，确定了６０＂－－８０目的聚酰胺分离纯化效果最好；赵丹等【５９】通过实验分析得出聚酰胺为吸附层析纯化越南巨竹竹叶中最佳工艺流程；吕金良等唧】研究了维药芹菜籽黄酮类的化学成分，采用聚酰胺、正相和反相硅胶柱色谱法分离纯化，从芹菜籽的乙醇提取物的正丁醇萃取部分分离出了４个黄酮类化合物。聚酰胺柱层析在分离黄酮类化合物时具有独到之处，但它的死吸附较大，损失高，有时高达３０％，故当样品较少时应慎重使用。１．５．２．６高速逆流色谱法高速逆流色谱（１ｉｉ曲．ｓｐｅｅｄｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＳＣＣＣ）是近年来发展起来的一种新型的液一液分配色谱技术。它依靠聚四氟乙烯（ＰＴＦＥ）蛇形管的方向性及特定的高速行星式旋转产生的离心场作用，使无载体支持的固定相稳定的保留在蛇形管中。并使流动相单向、低速通过固定相。在短时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中高速分配，继而达到连续逆流萃取分离物质的目的。与其他分离技术相比，ＨＳＣＣＣ不用固相载体作固定相，且具有分离纯度高、样品回收率高、适用范围广、可一步制备纯品的优点，既适用于小量分析，也可用于规模纯化，在生物、医药、天然产物化学、环境分析、食品等领域具有广泛的应用。特别是在天然产物有效成分的分离、纯化、制备方面具有很大的优点。Ｐｅｎｇ［６１】等采用超临界流体萃取技术与高速逆流色谱相的结合从白花败酱草中分离出了三种黄酮类成分。通过对压力、温度、粒径和改性剂等因素的考察优化了提取条件，同时采用了流速梯度洗脱；Ｏｕｔ６２】等采用ＨＳＣＣＣ法使用两种分离柱（２６０ｍＬ的小柱和１２００ｍＬ的大柱），成功地分离出了大豆异黄酮，并使全部分离组分的纯度超过了９０％。随着ＨＳＣＣＣ技术的迅速发展，逆流色谱将在分离制备方面发挥越来越重要硕士学位论文第一章绪论的作用。主要应用于精细纯化。和质谱仪、红外光谱仪或蒸发光散射仪等联用，应用前景十分广阔。１．５．３黄酮类化合物分析１．５．３．１分光光度法采用分光光度法测定植物中总黄酮含量是目前普遍运用的方法。其主要包括三氯化铝分光光度、法【６３】，硝酸铝分光光度法【矧。以芦丁为例，三氯化铝分光光度法显色原理是ＮａＮ０２、Ａ１Ｃ１３、ＮａＯＨ试剂与芦的Ｂ环的３’，４７．邻二酚羟基部位反应产生红色物质；硝酸铝分光光度法原理是Ａ１３＋与３．或５．羟基与４．羰基，或Ｂ环的３７，４７一邻二酚羟基络合显色【６５１。罗宪堂ｍ】等利用该法测定了山香圆叶中的总黄酮的含量；尉芹【６。７】等发现硝酸铝比色法在测定杜仲总黄酮时的主要干扰因素是绿原酸，他们采用纸层析法将样品中的黄酮与绿原酸分离后，再利用硝酸铝比色法测定黄酮的含量，从而提高了测定的准确度。１．５．３．２薄层扫描法薄层扫描法是将配制成一定梯度浓度的标准对照液点于同一硅胶Ｇ板或ＧＦ２５４板上，用展开剂展开，薄层扫描色谱峰，以峰面积对浓度作图得工作曲线，然后对样品液进行测试得到黄酮类化合物含量。何静等㈣采用硅胶ＧＦ２５４板，用氯仿：甲醇：醋酸（８：１５：０．２５）做为展开剂，双波长反射法线性扫描水红花子中花旗松素，取得了较好的测定结果。１．５．３．３高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法高效液相色谱广泛应用于化学分析中，其特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析分离生物、医学大分子、离子化合物等。Ｃｈｅｎ［６９】等用反相高效液相色谱法，采用ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣ１８色谱（２５０ｘ４．６ｍｍ，５斗ｍ），甲醇．０．３％水溶液为流动相梯度洗脱，在２６０ｎｍ下同时测定了ＲｈｉｚｏｍａＳｍｉｌａｃｉｓＧｌａｂｒａｅ中ｔａｘｉｆｏｌｉｎ，ｎｅｏａｓｔｉｌｂｉｎ，ａｓｔｉｌｂｉｎ，ｎｅｏｉｓｏａｓｔｉｌｂｉｎ和ｉｓｏａｓｔｉｌｂｉｎ五种黄酮类化合物；王靖等【＿７０】用高效液相色谱法测定了银杏制品经过酸水解后的３种黄酮甙元：槲皮素、山奈素、异鼠李素，并且效果较好。１．５．３．４电化学分析法电化学方法一种是利用待测物的电化学性质来进行测定的方法，主要有极谱法，库仑滴定法，离子选择电极法三种，其中在黄酮类化合物的检测中使用库仑滴定法相对较多，例如：余红等【７１】采用了库仑滴定法以黄酮化合物中羟基红花黄色素（ｈｙｄｒｏｘｙ－ＳＹＡ）为对照品测定了四种红花样品，总黄酮含量无明显差异。胡卫兵等【嘲用库仑滴定法测定银杏叶中总黄酮的含量，结果表明此方法的精密度达到了１．２５％。１．５．３．５荧光分析法由于黄酮类化合物具有平面共轭大分子结构，在紫外光照射下具有较强的荧光发射，故可以通过测定荧光强度进行定量分析。庞志功等【７３Ｊ厍Ｊ１３．环糊精单分子胶束荧光法测定西藏雪莲花的总黄酮；牟兰掣７４１以４３３ｎｍ为激发波长，４９５ｎｍ为发射波长，测定了蜂胶中总黄酮的含量，方法简便、快捷、准确。１．５．３．６毛细管电泳法毛细管电泳具有方法简单灵敏，重现性好、高效微量等优点。ＬｕＴｉｎｇ等利用电泳法检测蜂胶中包括的金合欢素、槲皮素在内的１１种黄酮类化合物和健康食品中常见的六种黄酮类化合物。１．５．３．７其它方法庞志功等采用精单分子胶束荧光法测定西藏雪莲花中总黄酮。ＷｅｉＷｕ等用色谱．电喷雾电离串联质谱分析鉴定黄芩中黄酮。１．６黄酮类化合物生物活性１．６．１黄酮类化合物的生物活性黄酮类化合物在人体中具有许多的药理和生物活性，如抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗血栓、抗诱变、抗癌和抗菌等作用‘７５刁８１。１．６．１．１抗氧化活性黄酮类化合物作为抗氧化剂能够阻碍食物由于氧化作用而引起的氧化腐败，对油脂类、脂溶性成分及其他天然组分起保护作用【７９。８０】；由于多酚羟基具有很强的还原性，许多黄酮类化合物已被证实具有很强的清除活性氧自由基的能力［８１－８３】，是和好的天然抗氧化剂。黄酮类化合物清除自由基的能力是由两个主要因素共同作用的结果。一是黄酮类化合物分子中羟基的位置，ＡｍｅｈａＳｅｙｏｕｍｌ８４Ｊ等通过实验研究证明，黄酮类化合物清除自由基的能力受羟基的位置影响远比其中羟基数目的影响较大。例如对于分子中羟基个数相同的黄酮类化合物，有３位羟基的比没有３位轻基的清除自由基的能力要强；二是在黄酮化合物分子中，有２，３位双键存在的清除自由基活性也相对较强（如槲皮素＞ＪＬ茶素），ＤｉｍｉｔｒｉｏｓＩ［８５】等认为，这是因为２，３位双键和４位羰基形成共扼体系，有利于电子在Ａ，Ｂ环间的离域作用，提高了类黄酮自由基的稳定性，增大了其给电子能力。因而，有该结构的类黄酮清除自由基活性较强。此外，在黄酮类化合物发挥抗氧化作用时，其对于脂质膜双层（脂质体膜）的亲和力有很的重要影响。不仅类黄酮Ｂ环羟基的数量与位置对类黄酮插入脂质膜双层有影响，Ｃ环的立体结构也影响着类黄酮插入脂质膜双层。最近还证明异黄酮Ａ环５７位ＯＨ基的存在也可增加亲和力。１．６．１．２对心血管的作用人们对于黄酮类化合物对心血管的作用早有研究。近年来，多数学者大多通过对酶的作用来筛选天然药物的生物学活性且一种酶常常表现出多方面的药理作用。黄酮类化合物也一样，对多种酶有作用。苦参总黄酮具有抗心律失常的作用。用氯仿诱导小鼠室颤，乌头碱、哇巴因分别诱发大鼠、豚鼠的室性心律失常。苦参总黄酮能明显对抗乌头碱、哇巴因及氧仿诱发的动物室性心律失常【８６１。银杏叶总黄酮能够减轻急性心肌梗塞，家兔心肌缺血性损伤，缩小心肌梗塞面积【８７１。１．６．１．３抗炎和抗免疫作用黄酮类主要通过影响细胞的分泌过程而起到抗炎和抗免疫的作用。如黄芩茎叶总黄酮可抑制炎症的急性期病变与炎症后期结缔组织生成，作用强度强于阿斯匹林ｆ８８】。黄杞总黄酮（ＥＲｌ’Ｆ）能明显提高小鼠单核巨噬细胞对碳粒廓清功能【８９】。１．６．１．４抗肿瘤作用黄酮类化合物是通过促进肿瘤坏死因子，抑制致癌剂和抗氧化等多途径发挥疗效的。孔庆峰等［９０－９１】以蜂胶黄酮类化合物为主制成了组方对Ｓ．１８０、Ｈ．２２ｄ，鼠移植性肿瘤的生长，证明该组方对动物肿瘤具有显著的抑制作用。可见蜂胶中黄酮类化合物在抑制肿瘤及免疫调节等方面的应用具有很大的研究与开发潜力。硕士学位论文第一章绪论１．６．１．５抗癌及防癌作用近年来，不断有新的黄酮类化合物从许多植物中被分离，并表现出不同的抗癌效果，如黄芩【吲中的黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对癌细胞的生长、增殖和转移都有一定的抑制作用；柑桔属中的柑桔黄酮【９３１，蜂胶中的槲皮苷、皂草黄素掣蚓都有一定的抗癌及防癌作用。１．６．２黄酮类化合物的应用由于黄酮类化合物的这些生物活性使对它的研究进入了一个新的阶段，掀起了黄酮类化合物研究、开发利用热潮，使其在化妆品、医药、食品等工业中有广泛的应用。目前黄酮类化合物在食品工业中有如下两种应用：其一是黄酮类化合物可作功能性食品添加剂如天然甜味剂、天然抗氧化剂、天然风味增强剂和天然色素等。其二是可作生物类功能食品，市售的生物类黄酮功能食品琳琅满目，涉及到功能食品的许多方面：如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品等。生物类黄酮除还可广泛应用于医药及农药领域，用以开发具有特效功能的药品和驱虫、杀虫剂等【９孓９７】。生物类黄酮无毒，广泛存在于植物界中，人体不能合成，而且在体内代谢很快。人体摄取生物类黄酮主要来自于饮料、茶、咖啡、可可、果酒和啤酒，甚至醋都是它的重要来源，占总摄入量的２６％３０％。近年来虽然分离、提取了大量的新生物类黄酮，但对其吸收、代谢机制、活性机理，具有生理功能的活性基团、稳定性等方面仍缺乏全面的认识．。因此应加强此方面的工作，弄清其生理功能从而进行有效的分离及提取，为生物类黄酮在医药、食品工业中的应用提供有利的理论依据，加速植物资源的有效开发利用，生产出具有预防和治疗多种疾病的药品和天然保健品。１．７本课题研究目的和意义黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物，对人类的肿瘤、衰老、心血管等疾病的治疗和预防有着重要的意义。当人体内缺乏类黄酮时，易导致大脑和心脏功能不全、动脉硬化等疾病。人体自身不能合成类黄酮，主要依靠从蔬菜、水果、谷物等食物中摄取一定量的类黄酮，而且类黄酮在体内代谢很快，所以需要不断的补充。近年来黄酮类化合物一直成为国内外研究开发利用的热点之一，国内外许多专家对各种黄酮药理作用作了较深入的研究，使得黄酮的药理药效研究有了很大的发展。我国木瓜资源丰富，且里面含有较多的黄酮类物质，但从目前的研究状况来看，木瓜各方面的研究工作还很不完善，其化学成分的研究尚不够深入还缺少系硕士学位论文第～章绪论统性，有关报道也相对较少。因此本研究的目的主要有以下三点：一是采用现代分离分析技术，结合天然药物研究实际，重点突破中药木瓜中芦丁的分离纯化技术，如采用制备型高速逆流色谱从木瓜中得到较纯的芦丁单体；二是结合黄酮类化合物的生物活性，对木瓜中不同溶剂提取的提取物和芦丁进行了清除ＤＰＰＨ自由基的研究，旨在为天然药物木瓜的开发提供理论和实验依据；三是采用电感耦合等离子质谱法测定木瓜中的微量元素，研究木瓜中对人体有益和有害的元素含量，为进一步开发和利用木瓜提供了依据。硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定第二章木瓜中总黄酮的提取及测定本章对超声提取和微波提取木瓜中总黄酮的工艺条件进行了系统研究，以木瓜总黄酮得率为指标，对两种方法的提取效果进行了比较，确定了两种方法的最优提取工艺。总黄酮含量的定量分析方法主要有分光光度法、薄层层析法、高效液相色谱法三种方法，本章主要采用分光光度法测定木瓜中总黄酮的含量。２．１超声提取２．１．１实验部分２．１．１．１仪器与试剂ＦＷｌ００型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ＫＱ．５０ＤＥ型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；托盘天平芦丁对照品（中国药品生物制品检定所）；乙酸乙酯（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；甲醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；氯仿（衡阳市凯信化工试剂有限公司）；乙醇（长沙市有机试剂厂）；亚硝酸钠（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；三氯化铝（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；氢氧化钠（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；所有试剂均为分析纯；木瓜干２．１．１．２木瓜样品的制备将木瓜干烘干至恒重，放入粉碎机中制成粉末后备用，称取２．Ｏｇ木瓜粉末，加入一定量的溶剂，超声提取后抽滤，将滤液转移至１００ｍＬ容量瓶中定容，测定其中总黄酮含量，按（２．１）式计算得率。黄酮得率（ｇ／ｇ）＝旦×１００％（２一１）聊０式中：ｍ．木瓜粗提液中总黄酮的质量（ｇ）ｍｏ．木瓜原料的质量（ｇ）硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定２．１．２结果与讨论２．１．２．１提取溶剂的选择称取２．０９木瓜样品，分别用甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯和水作溶剂，按２．１．１．２实验方法，超声提取２０ｒａｉｎ，提取两次，每次２５ｍＬ，测得结果见图２．１。水Ｆｐ醇氯协厶敞厶酯己醇溶剂图２．１溶济对提取效果的影响从图２．１中可以看出，甲醇提取效率最高，乙醇次之，氯仿最低。由于甲醇的毒性比较大，故以下提取均采用乙醇作为溶剂。２．１．２．２溶剂浓度的影响称取２．Ｏｇ木瓜样品，分别用２５ｍＬ２５％、４５％、６０％、７５％、９５％（ｖ／ｖ）乙醇溶液４０。Ｃ下超声提取，提取两次，每次２０ｍｉｎ。总黄酮得率与乙醇浓度的关系如图２．２所示：图２．２乙醇浓度对黄酮得率的影响１６Ｏ９８７●５哥难匿收硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定结果表明，黄酮得率随乙醇浓度的增大而提高，但当乙醇浓度大于４５％以后，黄酮得率开始下降，而同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加。根据“相似相溶原理”，黄酮类化合物的溶出度与溶剂的极性有关，极性相近可达到最大溶出度，故选择４５％的乙醇为最佳提取溶剂。２．１．２．３提取时间的影响根据２．１．２．２实验方法，固定其他条件，考察提取时间对总黄酮得率的影响，结果如图２．３所示。硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定２．１．２．５提取次数的影响１：１２１：１４料液比图２．４料液比对黄酮得率的影响根据２．１．２．２实验方法，固定其他条件，考察提取次数对总黄酮得率的影响。结果如图２．５。次。１．０１．５２．０２．５３．ｏ３．５４．ｏ提取次数图２．５提取次数对黄酮得率的影响结果表明，提取两次基本可以将总黄酮提取完全，故实验提取次数定为２２．１．２．６正交实验结果与分析在以上单因素实验的基础上，对影响木瓜中黄酮得率的因素：乙醇浓度、提饼馓伽ｍｍ…眦伽ｍｍⅢｍ誉哥苷｝陋般帖¨帖∞：２¨＂加，船台｝曝板硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定表２．２正交实验结果从表２．２中的直观分析和极差分析结果可知各因素对总黄酮提取的影响大小分别为Ａ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｄ，即乙醇浓度＞提取次数＞提取时间＞料液比；超声法提取木瓜中总黄酮的最佳提取条件为Ａ２８２Ｃ２Ｄ２，即４５％的乙醇，料液比１：１２，提取２次，每次２０ｒａｉｎ。按照得出的最优条件进行验证性实验，木瓜中总黄酮得率为１０．５４％。硕七学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定２．２微波提取２．２．１实验部分２．２．１．１仪器和试剂ＬＷＭＣ一２０１型微电脑微波化学反应器（南京陵江科技开发有限责任公司）２．２．１．２木瓜样品的制备准确称取２．Ｏｇｌ拘ｌ木瓜颗粒，加入一定量提取溶剂浸泡１０ｍｉｎ，于微波炉中提取后抽滤，将滤液用４５％乙醇溶解定容于ｌＯＯｍＬ容量瓶中，测定其中总黄酮含量。２．２．２结果与讨论２．２．２．１辐射功率的影响准确称取木瓜颗粒２．Ｏｇ，加入２５ｍＬ４５％的乙醇，于不同功率（１００Ｗ、２００Ｗ、３００Ｗ、４００Ｗ）下微波辐射４ｍｉｎ，测得木瓜中黄酮的得率，结果见图２．６。１∞瑚３００４００５∞辐射功率（－）图２．６辐射功率对黄酮提取率的影响由图２．６可知，随着微波提取功率增加，黄酮得率也随之增加，在Ｐ＝３００Ｗ后增加趋势较为平缓，故以下实验均选择功率为３００Ｗ。２．２．２．２辐射时间的影响：宝们：３¨”加：２¨辞静孵匿般硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定０＇２３４５Ｏ７００辐射时间（ｍ．Ｊ．ｎ）图２．７辐射时间对黄酮提取率的影响按２．２．２．１，固定其它条件，改变微波辐射时间（１ｍｉｎ，４ｍｉｎ，６ｍｉｎ，８ｍｉｎ），测得不同提取时间下黄酮得率，结果见图２．７。由图可知，增加辐射时间，黄酮的得率也随之增加，当辐射时间增大至Ｕ４ｍｉｎ后，总黄酮得率基本趋于不变，故选择辐射时间４ｍｉｎ为宜。２．２．２．３正交实验结果与分析参考超声提取部分单因素实验及微波辐射功率和辐射时间的影响，选择了乙醇浓度、辐射功率、辐射时间和料液比４个因素进行Ｌ９（３４）正交试验，结果见表２．３、２．４。表２．３微波提取正交实验因数水平表Ａ辐射时间（ｒａｉｎ）Ｂ乙醇浓度（％）Ｃ料液比Ｄ辐射功率（Ｗ）１４５１：１０１００２５０１：１２２００４５５１：１４３００２１¨¨”¨¨¨一－一铸嚏医牲硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定从表２．４中的直观分析和极差分析结果可知各因素对总黄酮提取的影响大小分别为Ｄ＞Ｂ＞Ａ＞Ｃ，即辐射功率＞乙醇浓度＞辐射时间＞料液比；微波法提取木瓜总黄酮的最佳提取条件为Ａ３８２Ｃ３Ｄ３，即辐射时间４ｌＴｌｉｎ，５０％的乙醇，料液比１：１４，微波辐射功率３００Ｗ。按照得出的最优条件进行验证性实验，木瓜中总黄酮得率为１２．３ｌ％。２．３．木瓜中黄酮的定性定量分析检测中草药中是否含有黄酮类化合物最为简单常用的方法就是显色反应，黄酮类化合物的基本骨架为２．苯基色原酮，其母核含有碱性氧原子，带有酚羟基，从而可以与某些还原剂产生颜色反应，与某些金属离子及其他一些试剂生成有色的络合物。用分光光度法测定提取物中总黄酮含量是目前普遍采用方法。本研究中采用三氯化铝一亚硝酸钠显色法，以芦丁为对照品，在一定波长下测定。其基本原理是：铝离子和具有３．羟基、４一羟基或５．羟基及邻二羟基结构的黄酮类化合物络合，并引起相应吸收带红移。硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定２．３．１实验部分２．３．１．１仪器与试剂ＦＷｌ００型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ＫＱ．５０ＤＥ型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；托盘天平；ＵＶ－９６００型紫外分光光度计（北京瑞利仪器有限公司）ｏ芦丁对照品（中国药品生物制品检定所）；亚硝酸钠（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；三氯化铝（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；氢氧化钠（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；所以试剂均为分析纯；木瓜干（购于湘雅二院）。２．３．１．２木瓜中总黄酮定性分析的方法１）ＨＣｌ．Ｍｇ反应取木瓜提取液ｌｍＬ，加入少许镁粉，振荡，再加浓盐酸舢５滴，观察颜色反应。若提取液变成桃红色，则说明提取液中可能含有黄酮、黄酮醇、双氢黄酮、异黄酮等黄酮类化合物。２）铅盐反应取木瓜提取液２ｍＬ，滴加２％中性醋酸铅试剂，观察颜色反应。若提取液中出现棕色沉淀，则说明提取液中可能存在邻二羟基黄酮类化合物。３）碱液反应取木瓜提取液ｌｍＬ，加入１０％ＮａＯＨ溶液５滴，观察颜色反应。若提取液变成黄色，则说明提取液中可能含有黄酮、黄酮醇、双氢黄酮、异黄酮等黄酮类化合物。２．３．１．３木瓜总黄酮定量分析的方法１）标准溶液的配：称取２０ｍｇ芦丁对照品，以４５％７，醇溶液超声溶解，并定容至５０ｍＬ，摇匀即得浓度为０．４ｍｇ・ｍＬ－１标准液，备用。２）样品制备：称取木瓜粉末２．０９，均采用２４ｍＬ４５％Ｋ，醇浸泡，超声２０ｍｉｎ，提取两次，抽滤，合并提取液于１００ｍＬ容量瓶中，用４５％乙醇定容至刻度，备用。２．３．１．４实验方法硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定按照超声提取的最佳工艺条件，取一定体积的制备的样品于比色管中，加入０．３ｍＬ４％亚硝酸钠溶液，摇匀，放置５ｍｉｒａ而后ＮＡｏ．３ｍＬ的５％三氯化铝溶液，摇匀，放置６ｍｉｎ；再加入４．０ｍＬ的４％氢氧化钠溶液，定容至１０ｍＬ，摇匀放置１２ｍｉｎ，在最佳测量波长处测定吸光度。２．３．２结果与讨论２．３．２．１定性分析颜色反应的结果如表２．５从表中可以看出，三种不同类型的定性反应结果都表明木瓜中还有黄酮类化合物。表２．５不同反应实验现象及结果２．３．２．２芦丁标准溶液最大吸收波长的测定准确移取芦丁标准溶液０．０、１．０ｍＬ分别置于比色管中，按２．３．１．４实验方法操作，用溶剂作空白，在波长４００ｎｍ～６００ｎｍ区间每隔５或１０ｎｍ测定一次吸光度，结果如图２．８。由图２．８可知芦丁对照品溶液经铝盐显色后，最大吸收波长并非为５１０ｎｍ，但由于在波长４２０ｎｍ前测得吸光度值不稳定，故选择吸收峰波长５１０ｎｍ为最佳定量测定波长。硕士学位论文第二章木瓜中总黄酮的提取及测定２．３．２．３显色稳定性实验４００４５０５００５６０６００波长（ｎｍ）图２．８芦丁对照品测定波长的选择¨：詈¨∞∞¨避紫督性关系良好。２．３．２．５精密度实验按线性关系考察的方法，分别精密移取１．０ｍＬ芦丁对照品试液５份，做平行实验，ＲＳＤ为０．３９％，表明该方法精密度良好。２．３．２．６加标回收率实验准确称取已知含量的木瓜粉末２．Ｏｇ，按高、中、低３个浓度（２４．０、１６．０、８．０ｌａｇ・ｍＬ－１入一定量对照品溶液，按２．１．２．２方法超声提取，测得结果见表２．６。表２．６加标回收率结果２．３．２．７木瓜总黄酮含量的测定及计算按２．３．１．４实验方法测定木瓜提取液的吸光度，计算出每毫升提取液中总黄酮含量，进而换算成每克木瓜中总黄酮含量。结果为：Ｏ．５２６％。２．４小结在单因素实验的基础上，对影响黄酮得率的因素（提取溶剂浓度、料液比、提取次数、提取时间、辐射功率）为变量进行正交实验，采ｍＬ９（３４）正交实验来确定对超声提取和微波提取方法的最佳提取工艺。其中超声提取最佳工艺为：４５％的乙醇，料液比１：１２，提取２次，每次２０ｒａｉｎ，黄酮得率为１０．５４％，微波提取的为：辐射时间４ｒａｉｎ，５０％的乙醇，料液比ｌ：１４，微波辐射功率３００Ｗ，黄酮得率为１２．３１％。通过两种方法的比较，微波提取法提取效果较优于超声提取法，但由于微波提取反应剧烈，较容易引起爆沸，在提取过程中不易控制，故还是采用超声提取较好。通过颜色定性反应实验证明了木瓜中含有黄酮类化合物。建立了以芦丁为对照品，用分光光度法测定木瓜总黄酮的方法，最大吸收波长为５１０ｒｉｍ，ＮａＮ０２．Ａ１Ｃ１３为显色剂，常温显色，得芦丁对照品浓度Ｃ（ｇｇ・ｍＬ。１）与吸光度Ａ的回归方程式：Ａ＝０．００９６Ｃ＋０．００９４（Ｒ＝０．９９９１），芦丁浓度在８～６４“ｇ・ｍＬｏ的范围内线性关系良好，ＲＳＤ为０．３９％，回收率在９６．３％，－，１０３．８％之间。硕士学位论文第三章木瓜中黄酮的纯化及芦丁的分析分离第三章木瓜中黄酮的纯化及芦丁的分析分离３．１木瓜中黄酮的大孑Ｌ吸附树脂纯化一般非极性的树脂用于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，强极性的树脂则适合从非极性溶剂中吸附极性物质，而中等的极性吸附树脂，不但能从非极性的介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。３．１．１实验部分３．１．１．１仪器与试剂ＦＷｌ００型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；２５０ｍＬ分液漏斗；ＳＨＩＭＡＤＺＵＡＹｌ２０型分析天平（日本岛津制作所）；ＫＱ一１００Ｅ医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ｒ－２０１旋转蒸发仪，Ｗ２０１Ｂ数控恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；７５６ＭＣ紫外可见分光光度计（上海精密仪器厂）；ＳＨＢ—ＩＶ双Ａ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；９５％乙醇、无水乙醇、甲醇、石油醚（湖南师大化学试剂厂）；氢氧化钠、亚硝酸钠（焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂）；硝酸铝（广州化学试剂厂）；所有试剂均为分析纯；Ｄ４０２０型、Ｓ．８型、Ｘ一５型、ＡＢ．８型和ＮＫＡ．９型大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；木瓜（长沙湘雅二院）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所）。３．１．１．２大孔吸附树脂的预处理树脂先用无水乙醇浸泡２４ｈ，充分溶胀，再用无水乙醇在提取器内提取８ｈ，以除去树脂中所含杂质。湿法装柱，依次用下列溶液冲洗：体积分数为９５％的乙醇洗至流出液澄清；水洗尽乙醇，５％盐酸进行淋洗，并浸泡２￣４ｈ，水洗至中性；２％的氢氧化钠溶液进行碱洗，再水洗至中性，即处理完毕。３．１．１．３大孔吸附树脂的再生硕士学位论文第三章木瓜中黄酮的纯化及芦丁的分析分离ｍ９５％（ｖ／ｖ）Ｚ，ｇ黼无色，然后以大量的去离子水洗去乙醇，即可进行下一次的吸附分离。当树脂反复使用后，吸附能力下降或受污染时需强化再生，则在容器内加入３％Ｎ５％盐酸浸泡树脂２到４ｈ，然后淋洗通柱约３－４倍树脂体积的盐酸溶液，用去离子水洗至中性；再用３ｏＡ～５％的ＮａＯＨ溶液浸泡树］］旨２－４ｈ，用３￣４倍同浓度碱溶液通柱，最后用蒸馏水洗至中性，备用。３．１．１．４木瓜提取液的制备按照２．１．２．６超声提取的最佳工艺条件进行提取，以水为溶剂配制成一定浓度的溶液，待用。３．１．１．５总黄酮含量的测定详见２．３．１．４。３．１．１．６大孔吸附树脂筛选选择Ｄ４０２０型、Ｓ－８型、Ｘ－５型、ＡＢ．８型、ＮＫＡ．９型５种大孔吸附树脂进行实验。测定这５种树脂对木瓜黄酮类化合物的静态吸附量、静态吸附率和解吸率以筛选树脂。取１．Ｏｇ预处理好的大孔吸附树脂于带塞的磨口锥形瓶中，加入黄酮浓度为１．２５４ｍｇ／ｍＬ的木瓜提取液５０ｍＬ，于室温下振荡（１８０ｒ／ｍｉｎ）２４ｈ至吸附平衡，过滤，滤液定容至５０ｍＬ，测定滤液中黄酮含量，按（３．１）、（３—２）式计算各树脂的静态吸附量和吸附率。用５０ｍＬ６０％乙醇溶液对吸附饱和的树脂进行解吸，测定解吸液中总黄酮含量，按（３—３）式计算解吸率。吸附量（ｍｇ儋）：皇上！巡（３—１）ｍ吸附率（％）：—（Ｃｏ－－—Ｃｅ）×１００％（３．２）Ｃｏ解吸率（％）＝—二ｌＬ×１００％（３．３）（ｃｏ。’ｃｏｇ其中ｃｏ起始浓度，ｃｅ平衡浓度，Ｖ吸附液体积，ｍ树脂质量，Ｃ１为解吸液浓度，Ｖｌ为解吸液体积。硕士学位论文第三章木瓜中黄酮的纯化及芦丁的分析分离３．１．１．７动态吸附一解吸实验取３０９已预处理的树脂，湿法装．Ｎ．２ｃｍｘ５０ｃｍ层析柱中，室温下木瓜提取液以一定的浓度和流速通过层析柱，吸附５ｈ后用洗脱液洗脱，分别考察上柱液的浓度、流速、洗脱液浓度、流速对树脂吸附一解吸性能的影响，确定最佳的吸附一解吸工艺条件。３．１．２结果与讨论３．１．２．１大孔吸附树脂筛选按实验３．１．１．５方法，５种树脂在相同的条件下测得其静态吸附解吸结果如表３．１所示。表３．１大孔吸附树脂的结构性能参数及静态吸附解吸结果由表３．１可知，Ｓ一８型大孔吸附树脂对木瓜中黄酮有较高的吸附量和解吸率。树脂的极性（功能基）和空间结构（孔径、比表面积、孔容）是影响吸附性能的重要因素。实验所用树脂有极性、弱极性、非极性３种类型。由表３．１可见，吸附量较大的多为极性或弱极性树脂，如Ｓ．８型、ＮＫＡ－９型和ＡＢ．８型。由此可以看出木瓜中黄酮类化合物多为强极性或弱极性。树脂仅具有适当的功能基还不够，其吸附性能还与树脂的孔径有关，因为有机物只有通过树脂的孔径扩散到树脂孔内表面才能被吸附，只有当孔径足够大时，比表面积才能充分发挥作用，从而使树脂吸附具有一定的选择性。因此所选的树脂吸附能力大小与黄酮类化合物的分子量和构型有关，孔径大小直接影响不同大小分子硕士学位论文第三章木瓜中黄酮的纯化及芦丁的分析分离的自由出入。树脂的实际应用由树脂的极性、孔径、比表面、孔容的综合性能决定，所以对其性能的评价要从吸附量、解吸率等方面综合考虑。综上所述，针对木瓜中黄酮类化合物的特性，选择Ｓ．８型大孔吸附树脂进行进一步的研究。３．１．２．２动态吸附上柱液浓度的影响按实验３．１．１．７方法，以不同的浓度、１ＢＶ／ｈ流速分别上样３００ｍＬ，进行吸附。测定吸附后溶液中总黄酮浓度，计算吸附量，结果如表３．２。随着上柱液浓度的增大吸附量逐渐增大，在上柱液浓度增至１．５０ｍｇ／ｍＬ后，吸附量基本趋于不变。表３．２上柱液浓度对吸附的影响大孔树脂的分离纯化受上柱液的浓度的影响很大。对于一定量树脂，上样液浓度太低，如本实验浓度为０．５０ｍｇ／ｍＬ时，尽管吸附效率高，但是不能完全发挥树脂的作用，浪费树脂且使用效率低；浓度太大，如浓度为１．７５ｍｇ／ｍＬ时，虽然树脂的吸附容量比１．５０ｍｇ／ｍＬ时稍大，但同时黄酮类物质随上柱液流出更多，导致吸附率降低，造成了药液的浪费。所以综合考虑宜选择上柱液浓度为１．５０ｍｇ／ｍＬ。３．１．２．３动态吸附上柱液流速的影响将３