白木香种子超低温保存技术规程

T/CSMAXXXX－2018白木香种子超低温保存技术规程范围本标准规定了白木香[Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.]种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于白木香种子的超低温长期贮藏。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.6农作物种子检验规程水分测定GB/T3543.7农作物种子检验规程其他项目检验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。白木香Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（AquilariaLam.）常绿乔木，高5~15m。叶革质，圆形、椭圆形至长圆形或近倒卵形，伞形花序。渐危种，国家Ⅱ级重点保护野生植物。该植物老茎受伤后所积得的树脂为《中国药典》收载的名贵药沉香，用于治疗胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急。白木香果实Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.fruits果实为蒴果，其蒴果果梗短，卵球形，幼时绿色，长2cm～3cm，直径约2cm，顶端具短尖头，基部渐狭，密被黄色短柔毛，2瓣裂，2室，每室具有1粒种子。白木香种子Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.seeds白木香的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子褐色、卵球形，长约1cm，宽约5.5mm，疏被柔毛，基部具有附属体，附属体长约1.5cm，上端宽扁，宽约4mm，下端成柄状。种子超低温保存seedofcryopreservation指将经过前处理的白木香种子置于液氮（-196℃）中保存。种子的选择果实采收5月底至6月中旬，当果皮颜色由绿转为黄白，果实自然开裂，种子呈棕褐色时即可采收，去除果皮和附属体，取出种子。种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4℃冰箱中保存备用（存放时间不超过15d）。种子前处理生活力检测参照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法检测种子生活力。随机抽取30粒种子，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC溶液浸没种子，室温（25℃）避光放置4h后观察染色结果。生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数×100%待保存的白木香种子生活力应≥85%。含水量范围用尼龙网袋包裹白木香种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为5000:1，室温条件下干燥处理24~32h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由35%~45%降至11%~13%。参照GB/T3543.6中的高恒温烘干法（130℃烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。种子保存量白木香种子保存量不少于240粒，以便后期的活力检测使用。种子冷冻方式白木香种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的白木香种子放入5mL冻存管中（每管20粒种子），迅速投入液氮中保存。恢复培养种子解冻处理液氮中冻存24h后取出冻存管，取出2个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min。冻后种子生活力检测取出1管解冻后的种子，参照5.1~5.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥80%时视为保存成功。恢复培养将剩下1管解冻后的白木香种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度25℃~30℃，湿度70%~85%条件下培养，出芽周期大概20d。附录TTC的配制和保存方法精密称取TTC1.00g，溶于100mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6.5~7.5，置棕色瓶内4℃冰箱备用。磷酸缓冲液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氢钾溶于1L无菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氢钠溶于1L无菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸盐缓冲液）参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].XX，中国医药科技出版社，2015，185-186[2]中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第52（1）卷[M].科学出版社，2004（1999）：290[3]WangYinzheng.MichaelG.Gilbert.BrianMathew.ChristopherD.Brickell.LorinI.Nevling.Thymelaeaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2007.13:214-215.[4]傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学[M].中国科学文化出版社，2004:1[5]ReedBM.Pla