重组DNA与遗传工程课件

TheFlowofGeneticInformationDNARNAProteinTranslationTranscriptionReverseTranscriptionDNAReplicationRNAReplicationDNADNA DNA-dependentDNAPolymerase(DNAReplicase)DNA

RNA DNA-dependentRNAPolymerase(Transcriptase)RNADNA RNA-dependentDNAPolymerase(ReverseTranscriptase)RNA

RNA RNA-dependentRNAPolymerase(RNAReplicase)DNA合成酶、轉錄酶、反轉錄酶、RNA合成酶TheCentralDogma–分子生物學的中心教條:TheFlowofGeneticInformatio1遺傳工程（重組DNA)遺傳工程（重組DNA)2重組DNA技術的條件：1.

基本工具：enzymes2.

基因的來源:purifiedDNAorcDNA(complementaryDNA)3.

傳輸工具：transformation,infection,electroporation,microinjection,genegun4.

篩選技術:specificantibodyscreening,hybridization(radioactiveisotopeorfluorescentagentlabel),5.

基因表現：expressionvectors,proteinpurification重組DNA技術的條件：1.

基本工具：enzyme3ThetoolkitforDNAtechnology:1.

Restrictionenzymes限制脢:DanielNathans,HamiltonSmithandWernerArber(1978NobelPrize)

2.

DNAvector載體

3.Hostorganisms宿主ThetoolkitforDNAtechnology4Restrictionenzymes限制脢:1.DanielNathans,HamiltonSmithandWernerArber(1978NobelPrize),DNAligase黏合脢

Restrictionenzymes限制脢:1.Dani5重组DNA与遗传工程6互補DNA的製造互補DNA的製造7製備cDNA製備cDNA8分離特定基因的方法分離特定基因的方法9重组DNA与遗传工程10DNAvector載體：cloningvector選殖載體（Bacterialplasmids細菌質體、Bacteriophages噬菌體）Shuttlevectors穿梭載體（應用在酵母菌yeast和細菌之上）Retroviruses反轉錄病毒（藉由感染的方式）DNAvector載體：cloningvector選11大腸桿菌的質體大腸桿菌的質體12質體的放大圖質體的放大圖13重组DNA与遗传工程14重组DNA与遗传工程15細菌間質體基因的轉移細菌間質體基因的轉移16Hostorganisms宿主:(1)

Bacteria:優點：繁殖快速、容易操作，缺點：轉錄和轉譯調控機制與真核細胞不同(2)

Yeast:優點：真核細胞的調控，缺點：不易操作(3)

Animalorplantcell:優點：高等生物細胞的表現，缺點：不易接納外來DNA

Hostorganisms宿主:(1)

Ba17重組DNA的方法重組DNA的方法18重组DNA与遗传工程19遺傳工程的應用 一、DiagnosisofGeneticDiseases遺傳疾病的診斷 二、HumanGeneTherapy人類基因療法 三、Vaccines疫苗 四、Pharmaceuticalproducts藥品製造

五、Forensic法醫 六、Environment環保 七、Agricultural農業遺傳工程的應用 一、DiagnosisofGenet20GMO：基因重組生物GMO：基因重組生物21轉殖生長基因的老鼠轉殖生長基因的老鼠22Agricultural農業Transgenicanimals n

enlargevaluableparts n

resistanttopathagens n

improvedagriculturalproducts,suchaschangeAAscompositionsTransgenicplants Tiplasmid(Tumor-inducingplasmid)

Agrobacteriumtumefaciens根瘤土壤桿菌Antisensegenes反義基因抑制番茄成熟Agricultural農業Transgenicani23利用細菌轉殖植物細胞的方法利用細菌轉殖植物細胞的方法24轉殖致瘤基因的植物轉殖致瘤基因的植物25抗除草劑基因的棉花抗除草劑基因的棉花26螢光煙草：轉殖作物螢光煙草：轉殖作物27HumanGeneTherapy

人類基因療法SCID(severecombinedimmunodeficiency)重度混合免疫不全症1.retroviralvector+ADA(腺甘脫胺脢)Tlymphocyte

intravenousinjection2.ADAgenebonemarrowcellHumanGeneTherapy

人類基因療法SCI28DiagnosisofGeneticDiseases

遺傳疾病的診斷Cysticfibrosis囊性纖維變性Huntington'sdisease亨氏舞蹈症

DiagnosisofGeneticDiseases

29重组DNA与遗传工程30聚合脢連鎖反應

-1聚合脢連鎖反應

-131聚合脢連鎖反應

-2聚合脢連鎖反應

-232EnzymePolymerasebindsinglestrandedDNAatapointadjacenttoadouble-strandedstretch,andbindstodNTPs(deoxynucleotidetriphosphates)EnzymePolymerasebindsingles33ComponentsofPCRreaction:Enzyme(Taq,Vent,Pfu)AppropriatebuffersAmpledNTPsTemplateDNAPrimersCofactors(eg.Magnesium)ComponentsofPCRreaction:Enz34Thecycle1Denaturation 94or92℃,30sec/incubation Halfactivityafter30incubationsat94℃for60seceach. 60-120secforthefirststepThecycle1Denaturation35Thecycle2Annealing Tm=4(GCbases)+2(ATbases) 30-60sec/incubationThecycle2Annealing36Thecycle3Extension 72℃,500bp/30sec;500-1500/60secThecycle3Extension37Cycles

Example: Denature Annealing Extension cycles 94 45 72 5 94 55 72 30-35 94 55 72(10min)1

Cycles Example:38ConditionoftemperatureConditionoftemperature39重组DNA与遗传工程40DNA自動定序儀DNA自動定序儀41DNA自動定序儀DNA自動定序儀42autosequencerautosequencer43脂蛋白與膽固醇HDLs:高密度脂蛋白 將膽固醇運送到肝臟加以代謝LDLs:低密度脂蛋白 將膽固醇運送到利用或儲存細胞膽固醇所引起的冠狀動脈阻塞脂蛋白與膽固醇HDLs:高密度脂蛋白膽固醇所引起的冠狀動脈44Vaccines疫苗 Proteincoatofvirusorbacteria. Modifypathogen'sgenomeVaccines疫苗 Proteincoatofvi45Pharmaceuticalproducts

藥品製造 Insulin胰島素

Growthhormones生長激素

EPO(erythropoietin)紅血球生長素 Interferon（干擾素）Pharmaceuticalproducts

藥品製造 46Forensic法醫RFLPDNAfingerprintingForensic法醫RFLP47DNA電泳DNA電泳48重组DNA与遗传工程49DNA指紋辨識DNA指紋辨識50Environment環保DetoxificationminingEnvironment環保Detoxification51請舉例說明運用在生物科技中的物理、化學基本技術和原理請舉例說明運用在生物科技中的物理、化學基本技術和原理52參考習題：怎樣從細胞中分離出我們想要研究的基因片段？怎樣鑑定所分離的基因是我們想要找的正確目標？如何在試管中複製DNA？怎樣證明王小姐未來所生的小孩是鄭先生的？請提一個可能解決現代環境問題的遺傳工程技術。參考習題：怎樣從細胞中分離出我們想要研究的基因片段？53TheFlowofGeneticInformationDNARNAProteinTranslationTranscriptionReverseTranscriptionDNAReplicationRNAReplicationDNADNA DNA-dependentDNAPolymerase(DNAReplicase)DNA

RNA DNA-dependentRNAPolymerase(Transcriptase)RNADNA RNA-dependentDNAPolymerase(ReverseTranscriptase)RNA

RNA RNA-dependentRNAPolymerase(RNAReplicase)DNA合成酶、轉錄酶、反轉錄酶、RNA合成酶TheCentralDogma–分子生物學的中心教條:TheFlowofGeneticInformatio54遺傳工程（重組DNA)遺傳工程（重組DNA)55重組DNA技術的條件：1.

基本工具：enzymes2.

基因的來源:purifiedDNAorcDNA(complementaryDNA)3.

傳輸工具：transformation,infection,electroporation,microinjection,genegun4.

篩選技術:specificantibodyscreening,hybridization(radioactiveisotopeorfluorescentagentlabel),5.

基因表現：expressionvectors,proteinpurification重組DNA技術的條件：1.

基本工具：enzyme56ThetoolkitforDNAtechnology:1.

Restrictionenzymes限制脢:DanielNathans,HamiltonSmithandWernerArber(1978NobelPrize)

2.

DNAvector載體

3.Hostorganisms宿主ThetoolkitforDNAtechnology57Restrictionenzymes限制脢:1.DanielNathans,HamiltonSmithandWernerArber(1978NobelPrize),DNAligase黏合脢

Restrictionenzymes限制脢:1.Dani58重组DNA与遗传工程59互補DNA的製造互補DNA的製造60製備cDNA製備cDNA61分離特定基因的方法分離特定基因的方法62重组DNA与遗传工程63DNAvector載體：cloningvector選殖載體（Bacterialplasmids細菌質體、Bacteriophages噬菌體）Shuttlevectors穿梭載體（應用在酵母菌yeast和細菌之上）Retroviruses反轉錄病毒（藉由感染的方式）DNAvector載體：cloningvector選64大腸桿菌的質體大腸桿菌的質體65質體的放大圖質體的放大圖66重组DNA与遗传工程67重组DNA与遗传工程68細菌間質體基因的轉移細菌間質體基因的轉移69Hostorganisms宿主:(1)

Bacteria:優點：繁殖快速、容易操作，缺點：轉錄和轉譯調控機制與真核細胞不同(2)

Yeast:優點：真核細胞的調控，缺點：不易操作(3)

Animalorplantcell:優點：高等生物細胞的表現，缺點：不易接納外來DNA

Hostorganisms宿主:(1)

Ba70重組DNA的方法重組DNA的方法71重组DNA与遗传工程72遺傳工程的應用 一、DiagnosisofGeneticDiseases遺傳疾病的診斷 二、HumanGeneTherapy人類基因療法 三、Vaccines疫苗 四、Pharmaceuticalproducts藥品製造

五、Forensic法醫 六、Environment環保 七、Agricultural農業遺傳工程的應用 一、DiagnosisofGenet73GMO：基因重組生物GMO：基因重組生物74轉殖生長基因的老鼠轉殖生長基因的老鼠75Agricultural農業Transgenicanimals n

enlargevaluableparts n

resistanttopathagens n

improvedagriculturalproducts,suchaschangeAAscompositionsTransgenicplants Tiplasmid(Tumor-inducingplasmid)

Agrobacteriumtumefaciens根瘤土壤桿菌Antisensegenes反義基因抑制番茄成熟Agricultural農業Transgenicani76利用細菌轉殖植物細胞的方法利用細菌轉殖植物細胞的方法77轉殖致瘤基因的植物轉殖致瘤基因的植物78抗除草劑基因的棉花抗除草劑基因的棉花79螢光煙草：轉殖作物螢光煙草：轉殖作物80HumanGeneTherapy

人類基因療法SCID(severecombinedimmunodeficiency)重度混合免疫不全症1.retroviralvector+ADA(腺甘脫胺脢)Tlymphocyte

intravenousinjection2.ADAgenebonemarrowcellHumanGeneTherapy

人類基因療法SCI81DiagnosisofGeneticDiseases

遺傳疾病的診斷Cysticfibrosis囊性纖維變性Huntington'sdisease亨氏舞蹈症

DiagnosisofGeneticDiseases

82重组DNA与遗传工程83聚合脢連鎖反應

-1聚合脢連鎖反應

-184聚合脢連鎖反應

-2聚合脢連鎖反應

-285EnzymePolymerasebindsinglestrandedDNAatapointadjacenttoadouble-strandedstretch,andbindstodNTPs(deoxynucleotidetriphosphates)EnzymePolymerasebindsingles86ComponentsofPCRreaction:Enzyme(Taq,Vent,Pfu)AppropriatebuffersAmpledNTPsTemplateDNAPrimersCofactors(eg.Magnesium)ComponentsofPCRreaction:Enz87Thecycle1Denaturation 94or92℃,30sec/incubation Halfactivityafter30incubationsat94℃for60seceach. 60-120secforthefirststepThecycle1Denaturation88Thecycle2Annealing Tm=4(GCbases)+2(ATbases) 30-60sec/incubationThecycle2Annealing89Thecycle3Extension 72℃,500bp/30sec;500-1500/60secThecycle3Extension90Cycles

Example: Denature Annealing Extension cycles 94 45 72 5 94 55 72 30-35 94 55 72(10min)