基因工程工具酶(同名324)课件

基因工程

GeneEngineering彭银祥等编著华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷第3章基因工程工具酶ToolEnzymesinGeneEngineering高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材1基因工程

GeneEngineering彭银祥等编著华中科基因工程的四大要素工具酶toolenzymes目的基因interestedgene载体vector受体细胞receiptcells2基因工程的四大要素2重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接；②缺口平移制作高比活探针；③DNA序列分析；④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记等多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶PCR合成DNA片段3重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功基因工程实验中常用的工具酶内切酶连接酶聚合酶修饰酶多核苷酸激酶末端转移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶碱性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶4基因工程实验中常用的工具酶内切酶多核苷酸激酶43.1限制性内切酶3.1.1细菌的限制-修饰系统（R-M系统）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGMeMeRestrictionModificationREcoRIMEcoRI限制与修饰系统的生物学意义1保护自身DNA不被降解；2破坏外源DNA，防止DNA的转化，保证物种的遗传稳定性。53.1限制性内切酶3.1.1细菌的限制-修饰系统（R-第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶3.1.2限制内切酶的命名EcoRI：EscherichiacoliRIHindIII：Haemophilus

influensaedIIISacI：Streptomyces

achromagenesI6第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名HindⅢ3.1.3限制性内切酶分类限制修饰系统的种类

（a）I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因产物构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。（b）II型：限制与修饰基因产物独立起作用。（c）III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。73.1.3限制性内切酶分类限制修饰系统的种类7核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG8核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶I切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用9切割位点在距离识别位点至少1000位于寄主特异性位点或其附近I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割。l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。10I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上限制酶特点：1.识别４-8个相连的核苷酸，以6个多见；3.1.4限制性内切酶的识别序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’NotI5’-GCGGCCGC-3’

3’-CGCCGGCG-5’2.呈回文结构(palindrome)；3.旋转对称性；EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。FokI5’-GGATGNN

-3’3’-CCTAC

NN-5’外侧，产生3’-端突起5.识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。11限制酶特点：3.1.4限制性内切酶的识别序列BamHI3.1.5限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端a)5’突出的粘性末端如,EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’b)3’突出的粘性末端如,PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’c)平末端

如,SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’123.1.5限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。（1）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’3.1.6同列裂酶和同尾酶13同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：Asp718I5’-G

GTACC-3’3’-CCATG

G-5’KpnI5’-GGTAC

C-3’3’-C

CATGG-5’14XmaI5’-CCCGGG-3’识别位点相同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（2）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。15同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ

5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A165’-GATC----3’Sau3A同尾酶的粘性末端互相同裂酶

（Isoschizomers）EnzymeSequenceIsoschizomersAcc65IGGTACCCCATGGAsp718I,KpnIAhaIIITTTAAA

AAATTTDraIBstMAICTGCAGGACGTCPstIEcoRIGAATTCCTTAAGFunIINdeICATATGGTATACFauNDINheIGCTAGCCGATCGAsuNHI,BmtINotIGCGGCCGCCGCCGGCGCciNISmaICCCGGGGGGCCCCfr9I,PspAI,XmaI,XmaCIRestrictionendonucleasesthatrecognizethesamesequenceareisoschizomers.17同裂酶（Isoschizomers）EnzymeSeq同尾酶

（

Isocaudamers

）EnzymeSequenceIsoschizomersBamHI5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’BclI,BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BamHI,BglIIBglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI,BamHIPstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-3’NsiI,5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-3’NsiI5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-5’PstIRestrictionendonucleasesthatrecognizethedifferenttargetsequenceandcutdownthesamesequencesstickyendsareisocaudamers.18同尾酶（Isocaudamers）EnzymeSequ3.1.7限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算193.1.7限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度3.1.8

影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积（>20l）一般采取20DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。21大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度对不完全消化具有一定的影响3.DNA的分子结构DNA的分子结构有三种超螺旋结构、线性结构、单链开环结构22对不完全消化具有一定的影响3.DNA的分子结构D是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。23是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045255.酶切消化反应的时间和温度

24不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有抑制作用。6.反应体积和甘油浓度质粒酶切鉴定通常设定反应体积为10-20μl,质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为80-100μl。25限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。7.星号（*）活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（*）活性26限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pHEcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！27EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。3.1.9限制酶酶切反应的终止几种常用限制酶识别位点28大多数酶可用65oC温育5分钟失活。3.1.9限制酶酶切29293.2DNA连接酶（Ligase）

DNA连接酶能利用ATP或NAD+提供的能量催化多段DNA片段的3’-OH和5’-P基团之间形成3’，5’-磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起。OHPOHPHOPHOPPPOHHO连接酶303.2DNA连接酶（Ligase）DN1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用机制及特点2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi311.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用机4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP324.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。335.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出A（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。3.2.2DNA连接酶的分类34（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件35（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH连接酶反应的最佳温度是37C。3.连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度所以一般采用4~16C。36连接酶反应的最佳温度是37C。3.连接反应的温度1.最增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例2.反应温度4.影响连接反应的因素10~20倍。一般12~16℃37增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.3.3DNA聚合酶（Polymerase）基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶383.3DNA聚合酶（Polymerase）基因工程中常1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。391.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶的特性比较40DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率3.3.1DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质①一条单链多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。413.3.1DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标记的D①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’-OH游离端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件-OH5’3’dNTPs42①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP①核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制备探针标记已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交43①核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5’3’44标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片③

DNA聚合酶I对探针序列的标记切口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标记：DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。45③DNA聚合酶I对探针序列的标记切口转移法(nickt5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。切口5’5’3’3’5’3’5’3’465’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个纯化的DNA片断DNaseI制造单链切口DNAPolI进行切口转移一种-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记47纯化的DNA片断DNaseI制造单链切口DNAPol3.3.2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenow片段的性质DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶483.3.2.Klenowfragment具有5’3’聚①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途49①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h503’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物51③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA（1）T4DNA聚合酶的性质3.3.3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性52（1）T4DNA聚合酶的性质3.3.3.T4DNA聚③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。53③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’545’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTP（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记55（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs56酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPs3.3.4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。573.3.4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一但与模板结合就会不间断地合成互补链。②3’5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍58（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一但与模板结②进行末端标记①以大分子量DNA为模板的合成如M13③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法标记3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。59②进行末端标记①以大分子量DNA为模板的合成如M13③修饰后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7DNA聚合酶的用途①DNA测序双脱氧法。②标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端60修饰后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去3.3.5.反转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成。613.3.5.反转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病①链有反转录活性和RNaseH活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA62①链有反转录活性和RNaseH活性。RNaseH：RN（3）逆转录酶的用途②链RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA63（3）逆转录酶的用途②链RNA-DNA杂交双链中5’3②合成DNA探针用随机引物（randomprimer）或oligodT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）③RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。64②合成DNA探针用随机引物（randomprimer）或1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。（1）细菌性碱性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase，BAP（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。SDS中加热68ºC可完全失活。3.4其他DNA修饰酶3.4.1碱性磷酸酶651.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。（1）细菌性碱性磷2.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接662.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’5’5’67单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTHindA-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。68A-OHHO-AGCTTOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA69AAGCTTAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。1、单链DNA外切酶1)大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’3’外切识别5’-OH2)大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’、3’5’外切识别3’-OH、5’-P3.4.2核酸外切酶（Exonucleases）70是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。1、单链DN2、双链DNA外切酶1)核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’外切识别3’-OH主要用途：在DNA双链的末端产生出单链区域。5’5’5’5’exoⅢ与klenow配合进行3’端标记-OHHO-712、双链DNA外切酶1)核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’52.核酸外切酶（

exo）5’3’外切。主要用途：使DNA双链变成单链（短）。5’P--P5’5’5’

exo成为测序模板。识别5’-P（但不能降解5’-OH）722.核酸外切酶（exo）5’3’外切。主要用途：使3.T7基因6核酸外切酶5’3’外切。用途与

exo一样。既能识别5’-P，又能识别5’-OH。5’5’5’5’已被克隆到大肠杆菌中表达。733.T7基因6核酸外切酶5’3’外切。用途与exo一DNA外切酶切割方式识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’3’5’-OH大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’3’5’5’-P3’-OH双链核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’3’-OH核酸外切酶（

exo）5’3’5’-PT7基因6核酸外切酶5’3’5’-P5’-OH74DNA外切酶切割方式识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶I（exo1.来源稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）。2.特性（1）高度单链特异性（2）反应条件①低水平Zn2+②pH4.0~4.33.4.3S1核酸酶751.来源稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）。3.S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。S1S1发卡或有缺口的部位。763.S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链ATGCATGCATGCTACGTACGTACGT甚至能识别单个核苷酸的单链区！（3）降解限制酶切形成的单链突出端。77（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链ATGCAT4.S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再与RNA杂交某限制酶位点（参照物）内切酶位点不能位于内含子序列中！RNA784.S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S12RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。RNA位置不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。mRNADNA（2）用mRNA测定基因中的外显子序列79RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。RNA位置Bal31核酸酶1.来源埃氏交替单胞菌（Alteromonoasespejiana）2.功能既有单链特异的DNA（RNA）内切酶；又有双链特异的DNA外切酶。降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。80Bal31核酸酶1.来源埃氏交替单胞菌（Alteromo4.Bal31的用途定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。3.反应条件Mg2+、Ca2+EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应。EcoRIEcoRIBamHIHindIII814.Bal31的用途定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原DNA中的位置。用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加入EGTA终止反应，再酶切电泳。Bal31控制消化法：82与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。用BEcoRIEcoRIBamHIHindIII分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。EcoRIBamHIHindIIIMarker83EcoRIEcoRIBamHIHindIII分别用各EcoRIEcoRIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIBamHIHindIIIBal31分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。HindIIIEcoRIBamHIMarker84EcoRIEcoRIBamHIHindIIIEcoR（a）特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置

（b）用途

切口平移（nicktranslation)，制备DNA探针

制备RNA样品时除去DNA分子

基因突变时产生切口

3.4.4DNA酶85（a）特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNase的识别（a）RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子。（b）RNaseH

作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。3.4.5RNA酶86大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样3.4.53.4.6T4多核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。873.4.6T4多核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的pseT基5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。885’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’碱性磷酸酶（1）正向反应（forwardreaction）89多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端的磷酸交换。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。90（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP3.4.7末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小牛胸腺。2.组成大小两个亚基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）913.4.7末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小牛胸腺。2.②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端转移酶92②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。③底物4.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶934.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow补平94（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTT5’5’HiAAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA95AAGCTAGCTTAAGCATTTAGCAAGCTTTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位点HindⅢ位点连接96AAGCTTTTAGCTTAAAAAAHi3.5核酸探针的标记3.5.1探针探针：是一段带有检测标记的已知核酸序列，它能过与待检测DNA序列特异性互补结合。

1DNA探针切口平移法，随机引物法，末端转移法，

PCR法等等。

2RNA探针

RNA聚合酶体外合成法973.5核酸探针的标记3.5.1探针973.5.2核酸标记物的选择放射性同位素标记物

标记DNA探针

α-32p-dGTPγ-32p-dGTP

α-32p-GTP非放射性同位素标记物生物素，地高辛的标记物983.5.2核酸标记物的选择放射性同位素标记物非放射性同位3.5.3探针的标记策略1.放射性同位素标记（1）切口平移法（2）末端标记法（3）随机引物法2.非放射性同位素标记993.5.3探针的标记策略1.放射性同位素标记2.非放Thanks!100Thanks!100基因工程

GeneEngineering彭银祥等编著华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷第3章基因工程工具酶ToolEnzymesinGeneEngineering高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材101基因工程

GeneEngineering彭银祥等编著华中科基因工程的四大要素工具酶toolenzymes目的基因interestedgene载体vector受体细胞receiptcells102基因工程的四大要素2重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接；②缺口平移制作高比活探针；③DNA序列分析；④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记等多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶PCR合成DNA片段103重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功基因工程实验中常用的工具酶内切酶连接酶聚合酶修饰酶多核苷酸激酶末端转移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶碱性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶104基因工程实验中常用的工具酶内切酶多核苷酸激酶43.1限制性内切酶3.1.1细菌的限制-修饰系统（R-M系统）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGMeMeRestrictionModificationREcoRIMEcoRI限制与修饰系统的生物学意义1保护自身DNA不被降解；2破坏外源DNA，防止DNA的转化，保证物种的遗传稳定性。1053.1限制性内切酶3.1.1细菌的限制-修饰系统（R-第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶3.1.2限制内切酶的命名EcoRI：EscherichiacoliRIHindIII：Haemophilus

influensaedIIISacI：Streptomyces

achromagenesI106第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名HindⅢ3.1.3限制性内切酶分类限制修饰系统的种类

（a）I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因产物构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。（b）II型：限制与修饰基因产物独立起作用。（c）III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。1073.1.3限制性内切酶分类限制修饰系统的种类7核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG108核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶I切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用109切割位点在距离识别位点至少1000位于寄主特异性位点或其附近I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割。l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。110I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上限制酶特点：1.识别４-8个相连的核苷酸，以6个多见；3.1.4限制性内切酶的识别序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’NotI5’-GCGGCCGC-3’

3’-CGCCGGCG-5’2.呈回文结构(palindrome)；3.旋转对称性；EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。FokI5’-GGATGNN

-3’3’-CCTAC

NN-5’外侧，产生3’-端突起5.识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。111限制酶特点：3.1.4限制性内切酶的识别序列BamHI3.1.5限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端a)5’突出的粘性末端如,EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’b)3’突出的粘性末端如,PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’c)平末端

如,SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’1123.1.5限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。（1）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’3.1.6同列裂酶和同尾酶113同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：Asp718I5’-G

GTACC-3’3’-CCATG

G-5’KpnI5’-GGTAC

C-3’3’-C

CATGG-5’114XmaI5’-CCCGGG-3’识别位点相同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（2）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。115同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ

5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A1165’-GATC----3’Sau3A同尾酶的粘性末端互相同裂酶

（Isoschizomers）EnzymeSequenceIsoschizomersAcc65IGGTACCCCATGGAsp718I,KpnIAhaIIITTTAAA

AAATTTDraIBstMAICTGCAGGACGTCPstIEcoRIGAATTCCTTAAGFunIINdeICATATGGTATACFauNDINheIGCTAGCCGATCGAsuNHI,BmtINotIGCGGCCGCCGCCGGCGCciNISmaICCCGGGGGGCCCCfr9I,PspAI,XmaI,XmaCIRestrictionendonucleasesthatrecognizethesamesequenceareisoschizomers.117同裂酶（Isoschizomers）EnzymeSeq同尾酶

（

Isocaudamers

）EnzymeSequenceIsoschizomersBamHI5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’BclI,BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BamHI,BglIIBglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI,BamHIPstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-3’NsiI,5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-3’NsiI5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-5’PstIRestrictionendonucleasesthatrecognizethedifferenttargetsequenceandcutdownthesamesequencesstickyendsareisocaudamers.118同尾酶（Isocaudamers）EnzymeSequ3.1.7限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算1193.1.7限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度3.1.8

影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积（>20l）一般采取120DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。121大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度对不完全消化具有一定的影响3.DNA的分子结构DNA的分子结构有三种超螺旋结构、线性结构、单链开环结构122对不完全消化具有一定的影响3.DNA的分子结构D是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。123是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045255.酶切消化反应的时间和温度

124不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有抑制作用。6.反应体积和甘油浓度质粒酶切鉴定通常设定反应体积为10-20μl,质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为80-100μl。125限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。7.星号（*）活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（*）活性126限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pHEcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！127EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。3.1.9限制酶酶切反应的终止几种常用限制酶识别位点128大多数酶可用65oC温育5分钟失活。3.1.9限制酶酶切129293.2DNA连接酶（Ligase）

DNA连接酶能利用ATP或NAD+提供的能量催化多段DNA片段的3’-OH和5’-P基团之间形成3’，5’-磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起。OHPOHPHOPHOPPPOHHO连接酶1303.2DNA连接酶（Ligase）DN1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用机制及特点2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi1311.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用机4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP1324.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5.3‘-OH对磷原子作亲核攻